一项原位工程化嵌合白细胞介素-2受体增强促炎性CAR巨噬细胞在肾细胞癌中的杀瘤活性的研究
本研究由山东大学药学院的靖伟强、韩茂森、王淦宇、石本康、蒋新义等学者合作完成，通讯作者为靖伟强、石本康和蒋新义。该研究成果发表于《自然·癌症》（Nature Cancer）杂志2025年5月第6卷第838至853页，于2025年4月29日在线发表。
肾细胞癌（renal cell carcinoma, RCC）是最具免疫原性的肿瘤之一，其特征是大量免疫抑制细胞浸润和强烈的免疫抑制性肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）。嵌合抗原受体巨噬细胞（chimeric antigen receptor macrophage, CAR-M）疗法在实体瘤中展现出巨大潜力，然而CAR-M在免疫抑制性肿瘤微环境中的表型再驯化限制了其持续的抗肿瘤免疫能力。具体而言，最初被工程化为具有杀瘤特性的炎症性M1表型的CAR-M，在肿瘤抑制性环境的影响下可能逆转为促进肿瘤生长的M2样表型。因此，如何在实体瘤的抑制性微环境中成功转化并维持编辑巨噬细胞的炎症性M1表型，是推动CAR-M疗法发展的关键技术进步。
针对上述挑战，研究团队设计并构建了一种嵌合白细胞介素-2受体（interleukin-2 receptor, IL-2R）—Toll样受体4（toll-like receptor 4, TLR4）信号受体（chimeric signaling receptor, CSR）。该CSR通过将IL-2受体的胞外段与TLR4受体的胞内段融合，使外源性IL-2能够激活TLR4信号通路，从而诱导巨噬细胞向M1表型极化。研究选用碳酸酐酶IX（carbonic anhydrase IX, CA9）作为CAR的靶抗原，因为CA9在肾癌组织中高表达且与患者不良预后相关，而在正常组织中几乎不表达。
研究团队采用环状RNA（circular RNA, circRNA）作为蛋白表达载体。与线性mRNA相比，circRNA具有共价闭合环状结构，对外切核酸酶具有高度抗性，稳定性更强。研究团队构建了编码IL-2R–TLR4 CSR的circRNA和编码抗CA9 CAR的circRNA，通过Sanger测序验证了circRNA的环化连接位点，并通过RNase R消化实验证实了circRNA的稳定性。实验证明，外源性IL-2刺激CSR后，可诱导NF-κB、JNK和p38的磷酸化，与野生型TLR4信号通路的激活模式一致，这一结果通过流式细胞术和Western blot分析均得到证实。
为了实现circRNA的体内高效递送，研究团队以柠檬酸为核心自主合成了一种可电离脂质NMS-C9H19，并通过微流控系统制备了脂质纳米颗粒（lipid nanoparticle, LNP）。通过优化NMS-C9H19、胆固醇、DOPE和PEG脂质的摩尔比，在摩尔比为15:25:20:1时获得了最佳转染效率，骨髓来源巨噬细胞（bone marrow-derived macrophage, BMDM）中GFP阳性率达到36.60%，显著高于商品化的DLin-MC3-DMA LNP。为提高巨噬细胞靶向性，研究团队在LNP表面修饰了甘露糖，形成了甘露糖偶联的LNP（mannose-conjugated LNP, MLNP）。甘露糖修饰后，LNP的粒径略有增加，zeta电位接近0 mV，circRNA包封率超过80%，透射电镜显示LNP呈清晰的球形形态。
为了实现药物的局部持续释放，研究团队开发了一种基于氧化透明质酸（HA-CHO）和酰肼接枝明胶（Gel-CDH）的可注射生物基质水凝胶。HA-CHO与Gel-CDH混合后通过席夫碱反应在数秒内形成水凝胶，扫描电镜显示水凝胶具有多孔不规则网络结构。流变学测试显示储存模量始终高于损耗模量，表明水凝胶具有良好的机械稳定性。水凝胶具有剪切变稀特性，可通过26号针头注射器连续注射。体外降解实验显示水凝胶具有浓度依赖性的降解特性，gel-1在5天内逐渐降解，gel-2约在8天内降解。药物释放实验显示LNP和IL-2均呈现初始快速释放相（前2天内累计释放超过30%），随后释放逐渐增加。在小鼠保留肾单位手术模型中，水凝胶表现出优于对照组的止血性能。
在体外功能验证中，共聚焦显微镜显示circRNA成功从溶酶体逃逸进入细胞质。流式细胞术分析表明，经MLNP处理后，28.65%的BMDM呈现CAR-Myc阳性表达，30.58%呈现CSR阳性表达，21.45%的BMDM同时表达CAR和CSR。RNA测序分析显示，联合处理导致大量M1型巨噬细胞标志物上调，M2型标志物下调。流式细胞术证实CD80（M1标志物）水平显著升高，CD206（M2标志物）水平降低。Western blot分析进一步证实iNOS（M1基因）表达上调和Arg-1（M2基因）表达下调。在吞噬功能方面，经IL-2激活的CA9特异性CAR-M对CA9+微珠的吞噬作用增强，对hCA9+ Renca细胞的吞噬率提高至26.20%，是对照组的16.1倍。ELISA检测显示TNF、IFNγ和IL-12的分泌水平显著升高。在与CD8+ T细胞共培养的实验中，经工程化巨噬细胞处理后，CD8+ T细胞的颗粒酶B和穿孔素表达显著增强，表明工程化巨噬细胞能够缓解CD8+ T细胞的抑制状态，恢复其杀伤活性。
在体内实验中，研究团队建立了BALB/c小鼠原位肾癌模型，通过超声引导将载药水凝胶注射至肾包膜下。生物发光成像显示，CAR-MLNP+CSR-MLNP/IL-2@Gel联合治疗组的肿瘤信号最低，表明抑瘤效果最佳。肿瘤肾脏重量测定同样显示该联合治疗组的抑瘤效果最好，对照组中位生存期为25.5天，而联合治疗组至第60天仍有80%的存活率。免疫细胞分析显示，联合治疗组中M1型巨噬细胞数量较对照组增加5.52倍，M2型巨噬细胞呈相反趋势；CD8+和CD4+ T细胞分别增加17.21倍和18.13倍；调节性T细胞（Treg）比例显著降低。动力学检测显示，CAR和CSR的表达在给药后约1周达到峰值（第6天分别为34.7%和37.3%），第15天降至2.01%和3.21%，但66.9%的巨噬细胞仍维持M1表型，提示CSR的初始激活可能建立了自我维持的促炎环境。在肺转移方面，联合治疗组最有效地减少了肺转移结节数量。研究还证实，水凝胶递送系统较直接给药显著增强了原发肾肿瘤和肺转移的抑制效果。巨噬细胞耗竭实验显著降低了疗效，表明CAR-M在肿瘤抑制中的关键作用；在缺乏T细胞的裸鼠中，远处转移抑制效果减弱，表明适应性免疫对完全的治疗效益不可或缺。
在术后模型中，研究团队在小鼠部分肾切除术后将水凝胶填充至手术腔。结果显示，联合治疗组伤口区域肿瘤细胞极少，被成纤维细胞替代，表明成功愈合。生物发光信号监测显示联合治疗组肿瘤复发率最低，中位生存期显著延长，肺转移显著减少。在人源化PDX模型中，使用移植了人造血干细胞的NOG-EXL小鼠建立肾癌模型，联合治疗同样显著抑制了肿瘤生长。安全性评估显示，circRNA-MLNP和水凝胶系统未引起明显的细胞毒性、凋亡或主要器官的组织病理学异常，血液常规和生化分析均未见显著不良反应。
本研究开发了一种将巨噬细胞原位编辑与细胞因子治疗相结合的新策略。研究团队自主设计了IL-2R–TLR4嵌合信号受体，利用circRNA作为蛋白表达载体，通过自主合成的可电离脂质NMS-C9H19制备甘露糖靶向LNP，并与可注射水凝胶联合递送，实现了对肿瘤相关巨噬细胞的原位重编程。该策略通过激活TLR4信号通路诱导M1极化、增强抗原特异性吞噬作用、逆转T细胞耗竭，最终在肾癌动物模型中取得了显著的原发肿瘤抑制和转移控制效果。研究亮点在于：第一，首次报道了利用IL-2临床细胞因子疗法通过合成受体激活TLR4信号通路的CSR设计，实现了巨噬细胞表型的可控调控；第二，采用circRNA作为蛋白表达载体，利用其高稳定性实现了持续的蛋白表达；第三，自主合成的可电离脂质和甘露糖靶向策略显著提高了巨噬细胞转染效率；第四，水凝胶局部递送系统不仅实现了药物的持续释放，还兼具物理支撑和止血功能，为术后辅助治疗提供了新的思路。该研究为肾癌及其他实体瘤的免疫治疗提供了有前景的新策略，但研究者也指出，所使用的鼠源肾癌模型在复制人类疾病的复杂性和时间进程方面存在局限性，未来需要在大动物模型和早期临床试验中进一步验证其临床可行性和安全性。