基于SERS-PLSR技术的阴道微生物群落光谱库构建研究

作者及发表信息

本研究由波兰科学院物理化学研究所（Institute of Physical Chemistry, Polish Academy of Sciences）的Sylwia Magdalena Berus、Agnieszka Kamińska团队主导，联合华沙大学（University of Warsaw）等机构的多位微生物学与临床医学专家共同完成，于2022年10月发表在*International Journal of Molecular Sciences*（DOI: 10.3390/ijms232012576）。

学术背景

研究领域：本研究属于微生物快速检测与光谱诊断技术交叉领域，聚焦阴道微生态健康。
科学问题：阴道微生物群落从共生状态向致病状态的转变（如细菌性阴道病BV、外阴阴道假丝酵母菌病VVC）的早期识别对临床诊疗至关重要，但传统方法（如PCR、气相色谱）存在耗时长、特异性不足等问题。
技术背景：表面增强拉曼光谱（Surface-Enhanced Raman Spectroscopy, SERS）可通过纳米银基底增强微生物表面分子的拉曼信号，结合偏最小二乘回归（Partial Least Squares Regression, PLSR）算法实现高精度分类。

研究流程

1. 微生物样本制备

研究对象：
- 共生菌：5种Lactobacillus spp.（如*L. crispatus*、*L. iners*）和4种Bifidobacterium spp.
- 病原体：
- 细菌：*Gardnerella vaginalis*（BV相关）、*Prevotella bivia*、*Streptococcus agalactiae*（B族链球菌）等
- 真菌：4种Candida spp.（如*C. albicans*、*C. glabrata*）
- 原生动物：*Trichomonas vaginalis*（滴虫）
培养条件：根据不同微生物需求选择MRS、TSA、RCM或巧克力琼脂培养基，标准化培养时间（48小时）后离心洗涤，制备悬浮液。

2. SERS基底制备与优化

创新方法：采用飞秒激光烧蚀硅片后镀100 nm银层（Si/Ag基底），通过物理气相沉积（PVD）实现高均匀性纳米结构。优势：无需化学试剂，信号重复性较传统胶体金法提升30%。

3. SERS光谱采集与预处理

• 仪器：Bruker Bravo光谱仪（DUO Laser™，700–1100 nm），分辨率2–4 cm⁻¹，单次测量时间6秒，累计3次。
  
• 数据预处理：基线校正（Concave Rubber Band算法）、平滑处理（5点窗口）、Min-Max归一化（600–1750 cm⁻¹范围）。
  

4. PLSR建模与变量分析

• 关联分组：
  
  • 念珠菌种间区分（Candida spp.）
    
  • 乳酸菌与双歧杆菌属间区分
    
  • BV病原体在MRS培养基上的分类
    
• 算法参数：使用Unscrambler软件（v10.3），通过X-loadings图识别关键变量（如Lactobacillus spp.的1400 cm⁻¹特征峰）。
  

主要结果

1. 微生物特异性光谱指纹

• 真菌标记峰：905 cm⁻¹（几丁质）、1209 cm⁻¹（β-1,3-葡聚糖），在*C. glabrata*与*C. albicans*区分中贡献98%方差解释率（前3个因子）。
  
• 细菌标记峰：
  
  • Lactobacillus spp.：1400 cm⁻¹（蛋白质）
    
  • Bifidobacterium spp.：613 cm⁻¹（苯丙氨酸）
    
• 滴虫标记峰：805 cm⁻¹（尿嘧啶）、1555 cm⁻¹（酰胺II带），与其表面脂磷聚糖（LPG）结构相关。
  

2. 培养基优化验证

关键发现：MRS培养基虽抑制部分病原体生长，但能最大化光谱差异（如*M. curtisii*在850–955 cm⁻¹区间的强信号），PLSR模型对BV病原体的分类准确率达89%。

3. 临床诊断潜力

通过模拟临床样本（混合*Lactobacillus*、*Candida*、*G. vaginalis*），证实SERS-PLSR可区分：
- 健康微生态（乳酸菌主导）
- BV（如*G. vaginalis*的923 cm⁻¹峰）
- VVC（真菌特征峰）

结论与价值

科学价值：
1. 首次建立包含真菌、细菌、原虫的阴道微生物SERS光谱库，填补了原生动物*T. vaginalis*的光谱数据空白。
2. 揭示微生物表面多糖（如几丁质）、蛋白质的振动模式与致病性的关联机制。
应用价值：为开发无需培养、快速（<10分钟）的阴道分泌物床旁检测（POCT）设备提供理论基础。

研究亮点

1. 技术创新：飞秒激光制备Si/Ag基底，克服传统SERS重复性差的瓶颈。
   
2. 跨学科模型：PLSR首次用于阴道微生物多类别分类，对临床混合感染诊断具有优势。
   
3. 临床相关性：明确*L. crispatus*（产H₂O₂型）与微生态稳定性的光谱相关性，支持其作为益生菌靶标的潜力。
   

其他发现

扫描电镜（SEM）显示：
- *C. albicans*在基底上形成假菌丝，其SERS信号强度与生物膜形成能力正相关（r = 0.72）。
- *T. vaginalis*的波动膜结构（SEM图像）与其1555 cm⁻¹酰胺信号强度相关，提示运动性与致病性关联。

本研究为阴道微生态失调的精准诊断提供了新范式，后续可拓展至其他黏膜感染（如口腔、肠道）的光谱库构建。