本研究由Adeleye Oluwatosin Adeshakin、Wan Liu、Funmilayo O. Adeshakin、Lukman O. Afolabi、Mengqi Zhang、Guizhong Zhang、Lulu Wang、Zhihuan Li、Lilong Lin、Qin Cao、Dehong Yan（通讯作者）和Xiaochun Wan（通讯作者）共同完成。作者团队主要来自中国科学院深圳先进技术研究院的生物医学与生物技术研究所、蛋白质与细胞药物研究中心、广东省免疫细胞治疗工程技术研究中心，以及中国科学院大学、锦州医科大学、深圳市儿童医院、东莞恩联干细胞生物技术研究所、香港中文大学和深圳宾德生物技术有限公司。该研究于2021年1月19日在线发表在学术期刊《Cellular Immunology》第362卷上。
学术背景 本研究属于肿瘤免疫学领域，具体聚焦于肿瘤微环境中的免疫抑制机制及联合治疗策略。尽管靶向PD-1/PD-L1轴的免疫检查点阻断（Immune Checkpoint Blockade, ICB）疗法取得了显著成功，但仅在少数癌症患者中能诱导持续反应。产生抵抗的主要原因之一是肿瘤微环境中存在免疫抑制细胞，如髓源性抑制细胞（Myeloid-Derived Suppressor Cells, MDSCs）。MDSCs通过多种机制，包括产生活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）、诱导精氨酸酶1（Arginase 1, Arg1）和诱导型一氧化氮合酶（inducible Nitric Oxide Synthase, iNOS）等，来抑制抗肿瘤免疫应答。因此，抑制MDSCs的免疫抑制功能对于提高癌症ICB疗法的成功率至关重要。
此前研究表明，脂质代谢是调节MDSCs功能的关键因素。脂肪酸转运蛋白2（Fatty Acid Transport Protein 2, FATP2）通过上调花生四烯酸代谢，赋予了多形核MDSCs（PMN-MDSCs）在癌症中的功能。然而，通过靶向FATP2来调节MDSCs中的脂质积累，能否控制ROS的产生并增强PD-L1阻断介导的肿瘤免疫治疗，此前尚未有研究探索。本研究的目的是揭示FATP2在调节MDSCs脂质积累和ROS产生中的作用，并探究靶向MDSCs中的FATP2能否增强抗PD-L1肿瘤免疫治疗的疗效。
详细研究流程 本研究包含体外和体内两大部分，流程严谨，环环相扣。
第一部分：体外机制探索 1. MDSCs的生成与处理：从野生型C57BL/6小鼠的骨髓中分离细胞，使用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor, GM-CSF）体外诱导5天，生成MDSCs（称为对照MDSCs）。为了模拟肿瘤微环境，在培养的最后48小时，向MDSCs培养体系中加入肿瘤组织裂解上清（Tumor Explanted Supernatant, TES）或特定脂肪酸（如亚油酸、油酸、α-亚麻酸、硬脂酸，浓度均为100 μM）。此外，还使用了FATP2的小分子抑制剂Lipofermata（1 μM）进行干预。 2. 表型与功能检测： * 脂质积累与摄取：使用荧光染料BODIPY 493/503检测细胞内的脂质含量；使用荧光标记的棕榈酸（BODIPY FL C16）评估细胞的外源性脂肪酸摄取能力。通过流式细胞术进行分析。 * ROS与线粒体功能：使用CM-H2DCFDA探针检测总ROS水平；使用MitoSOX Red检测线粒体超氧阴离子；使用MitoTracker Green检测线粒体质量。均通过流式细胞术完成。 * 基因与蛋白表达：通过实时定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）检测FATP家族成员（Slc27a1-6）、ROS产生相关基因（如gp91phox）、抗氧化基因（如Nrf2, Gpx, Sod家族）以及免疫抑制相关基因（如Arg1, iNOS, S100A8/A9）的mRNA表达水平。通过蛋白质印迹法（Western Blot）检测FATP2、FATP4、STAT3及磷酸化STAT3的蛋白表达。 * MDSCs的免疫抑制功能评估：将不同条件处理的MDSCs与从幼稚小鼠脾脏分离的CD3+ T细胞共培养（比例1:2），T细胞使用抗CD3/CD28抗体激活。通过CFSE染色检测T细胞增殖；通过细胞因子微球阵列（CBA）或细胞内染色结合流式细胞术，检测T细胞产生的IFN-γ和TNF-α水平。 3. 信号通路探究： * 使用GM-CSF中和抗体阻断GM-CSF信号。 * 使用STAT3特异性抑制剂Stattic或STAT5抑制剂处理细胞。 * 利用慢病毒介导的shRNA敲低MDSCs中的STAT3表达。 * 检测上述处理后，对FATP2表达、脂质积累、ROS产生的影响。
第二部分：体内动物实验 1. 肿瘤模型建立与治疗：在C57BL/6小鼠皮下接种B16F10（黑色素瘤）或LLC（Lewis肺癌）细胞建立肿瘤模型。当肿瘤可触及后，开始治疗。实验分组包括：对照组（Vehicle）、Lipofermata单药治疗组（每日腹腔注射）、抗PD-L1抗体单药治疗组（每三日腹腔注射）、以及Lipofermata与抗PD-L1抗体联合治疗组。定期测量肿瘤体积和鼠体重。 2. 样本采集与免疫细胞分析：治疗结束后，处死小鼠，收集脾脏、骨髓和肿瘤组织。制备单细胞悬液，通过流式细胞术全面分析免疫细胞组成，包括：MDSCs（CD45+CD11b+Gr-1+）、PMN-MDSCs（CD45+CD11b+Ly6G+Ly6Clow）、M-MDSCs（CD45+CD11b+Ly6G-Ly6Chigh）、树突状细胞（DCs）、巨噬细胞、CD3+ T细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、B细胞和NK细胞。同时分析肿瘤浸润CD8+ T细胞的活化标志物（CD107a, CD69）和PD-L1表达水平。 3. 离体功能验证：从治疗组小鼠的脾脏中分选出MDSCs，与幼稚T细胞共培养，评估其抑制T细胞增殖和细胞因子产生的能力。 4. 分子机制验证：从各组小鼠脾脏分选MDSCs，通过RT-qPCR和Western Blot检测FATP2、抗氧化基因、免疫抑制/刺激相关基因的表达变化。
主要结果 1. 肿瘤微环境促进MDSCs脂质积累和ROS产生：与无瘤小鼠相比，荷瘤小鼠脾脏和骨髓中的MDSCs及其亚群脂质含量和脂肪酸摄取能力显著升高。体外实验证实，TES和不饱和脂肪酸（油酸、α-亚麻酸）能浓度依赖性地增加MDSCs的脂质积累、脂肪酸摄取、ROS水平、线粒体质量，并增强其抑制T细胞增殖和IFN-γ/TNF-α产生的能力。 2. FATP2是调节MDSCs脂质积累和ROS的关键分子：RT-qPCR和Western Blot分析发现，TES处理或荷瘤小鼠来源的MDSCs中，FATP2（和FATP4）的mRNA和蛋白表达显著上调。使用FATP2抑制剂Lipofermata处理TES诱导的MDSCs，可以降低其脂质积累、ROS水平，并下调ROS产生关键组分gp91phox的表达，同时上调多种抗氧化基因（如Nrf2, Gpx2-4, Sod1-2）的表达。更重要的是，Lipofermata处理削弱了MDSCs的免疫抑制功能，表现为其抑制T细胞增殖和细胞因子产生的能力下降。 3. GM-CSF通过激活STAT3信号通路上调FATP2表达：肿瘤细胞是GM-CSF的主要来源。研究发现，GM-CSF（而非IL-6）能显著诱导骨髓来源CD11b+Gr-1+细胞的脂质摄取、FATP2表达和ROS产生。机制上，GM-CSF激活了STAT3信号通路。使用STAT3抑制剂Stattic或shRNA敲低STAT3，能有效抑制GM-CSF或TES诱导的FATP2表达上调和ROS产生。STAT5抑制也有部分降低ROS的作用。 4. 靶向FATP2在体内抑制肿瘤生长并重塑免疫微环境：在LLC和B16F10荷瘤小鼠模型中，Lipofermata单药治疗能显著抑制肿瘤生长，降低肿瘤重量。流式分析显示，治疗组小鼠肿瘤和脾脏中的MDSCs比例下降，而CD3+ T细胞（尤其是CD8+ T细胞）比例上升。从治疗组小鼠分离的脾脏MDSCs，其脂质积累和ROS水平降低，免疫抑制相关基因（Arg1, iNOS, S100A9）表达下调，免疫刺激分子（TNF-α, IL-12, CD80, CD86）表达上调，并且抑制T细胞功能的能力减弱。 5. 靶向FATP2与抗PD-L1疗法具有协同作用：联合使用Lipofermata和抗PD-L1抗体，相比任一单药，能更显著地抑制LLC和B16F10肿瘤的生长。机制上，联合治疗组小鼠肿瘤中浸润的CD8+和CD4+ T细胞数量进一步增加，CD8+ T细胞上的脱颗粒标志物CD107a表达显著升高，而PD-L1在CD8+ T细胞和总CD45+免疫细胞上的表达则进一步降低。此外，联合治疗协同削弱了脾脏MDSCs的免疫抑制功能，使其对T细胞增殖和IFN-γ产生的抑制能力降至最低。
结论与意义 本研究得出结论：肿瘤细胞来源的GM-CSF通过激活STAT3信号通路，上调MDSCs中FATP2的表达。FATP2的增加促进了肿瘤源性脂质的外源性摄取和积累，进而激活了ROS的产生，最终增强了MDSCs的免疫抑制功能，导致肿瘤进展。药理学阻断FATP2（使用Lipofermata）可逆转这一过程，降低MDSCs的免疫抑制活性，并增强抗PD-L1疗法的效果。其协同增效的机制在于：激活肿瘤浸润性T细胞（增加数量、上调CD107a）、降低T细胞上的PD-L1表达，以及进一步削弱MDSCs对T细胞的抑制作用。
科学价值：本研究首次揭示了FATP2在调控MDSCs脂质积累诱导的ROS及其免疫抑制功能中的关键作用，阐明了从肿瘤GM-CSF到STAT3-FATP2-脂质-ROS的信号轴。这为理解肿瘤微环境中代谢重编程如何驱动免疫抑制提供了新的视角。
应用价值：研究提出了一种克服抗PD-L1治疗耐药性的新策略：靶向MDSCs的脂质代谢（特别是FATP2）。Lipofermata作为一种FATP2抑制剂，与现有ICB疗法联用，展现出显著的协同抗肿瘤效果，具有潜在的临床转化价值。
研究亮点 1. 重要发现：首次证明FATP2通过调节脂质积累诱导的ROS来控制MDSCs的免疫抑制功能；首次证实靶向MDSCs中的FATP2可以增强抗PD-L1免疫治疗的疗效。 2. 机制新颖性：系统阐明了“肿瘤GM-CSF → STAT3激活 → FATP2上调 → 脂质摄取积累 → ROS增加 → MDSCs免疫抑制增强”的完整分子通路。 3. 方法全面性：研究结合了体外分子机制探索和体内双肿瘤模型验证，从细胞、分子、动物整体水平提供了多层次证据链。功能实验（共培养、细胞因子检测）与表型分析（流式细胞术）、分子检测（RT-qPCR, Western Blot）紧密结合。 4. 转化潜力突出：直接测试了FATP2抑制剂Lipofermata与临床已应用的抗PD-L1抗体的联合治疗效果，为从基础研究到临床应用的桥梁提供了扎实的临床前数据。
其他有价值内容 研究还观察到，FATP2在PMN-MDSCs和M-MDSCs两个亚群中均有表达，且Lipofermata对两者都有影响。此外，研究不仅关注了免疫抑制的削弱，还发现靶向FATP2能上调MDSCs自身的一些免疫刺激分子，这可能促进了其向更有利于抗肿瘤的表型转化。这些细节丰富了我们对靶向FATP2如何重塑肿瘤免疫微环境的理解。