热蛋白质组谱分析在组织中识别药物靶点：技术进展、应用与未来展望
引言 药物靶点发现是现代药物研发的核心环节。传统方法如基于靶点的发现或基于表型的发现各有优劣，但其同面临的挑战是准确识别化合物在复杂生物系统中的直接作用靶点和脱靶效应，这对优化药物疗效、预测毒性及理解作用机制至关重要。近年来，基于质谱的蛋白质组学技术为这一难题提供了强大的工具。其中，热蛋白质组谱分析作为一种无需化合物修饰、可在活细胞甚至组织中直接测量蛋白质与配体相互作用的创新技术，自2014年提出以来，已迅速发展并展现出独特的优势。本文旨在系统介绍TPP技术的原理、方法学发展、广泛应用及其在组织样本分析中的最新突破，并展望其在未来药物研发和基础生物学研究中的潜力。
一、 作者、出版信息与主题 本文是2021年9月9日在线发表，并于2022年正式刊登于《Annual Review of Pharmacology and Toxicology》（《药理学与毒理学年鉴》）上的一篇综述文章。主要作者包括来自欧洲分子生物学实验室（EMBL）基因组生物学单元的André Mateus、Nils Kurzawa（共同一作）、Mikhail M. Savitski，以及葛兰素史克旗下Cellzome GmbH的Jessica Perrin和Giovanna Bergamini。文章主题聚焦于热蛋白质组谱分析（Thermal Proteome Profiling, TPP） 这一技术，特别是其在组织样本中进行药物靶点识别的最新进展与应用。
二、 主要论点阐述
论点一：药物靶点反卷积的重要性与现有策略的局限。 文章开篇即阐述了药物发现中靶点反卷积（Target Deconvolution）的核心价值：它不仅能加速先导化合物的优化（通过明确主要靶点），还能预警潜在的毒性或副作用（通过识别脱靶效应）。文章系统梳理了现有的蛋白质组水平药物靶点识别方法，并将其分为两大类：1) 基于靶点富集的策略（如亲和纯化、基于活性的蛋白质谱分析、Kinobeads技术），以及2) 基于靶点生物物理性质变化的策略（如基于氧化速率的蛋白质稳定性分析、蛋白质“绘画”、有限酶解/药物亲和响应靶点稳定性测定）。 然而，这些方法大多存在局限。富集策略通常需要对化合物进行化学修饰（如添加亲和标签或光反应基团），这不仅增加了合成难度，也可能改变化合物原有的结合特性。Kinobeads技术虽无需修饰化合物，但主要局限于激酶靶点的鉴定。而早期的生物物理策略（如SPROX、DARTS）大多只能在细胞裂解液中进行，无法反映化合物在活细胞内的渗透、代谢及真实的靶点结合情况。因此，开发一种无需修饰、能在活体环境中直接监测药物-靶点相互作用的技术，成为该领域的迫切需求。
论点二：TPP技术的基本原理、独特优势及核心工作流程。 TPP技术巧妙地将细胞热转移分析（Cellular Thermal Shift Assay, CETSA） 的原理与多重定量质谱蛋白质组学相结合。其核心原理是：当小分子化合物（如药物）与细胞内蛋白质结合时，通常会改变该蛋白质的热稳定性（使其更耐热或更不耐热）。通过将细胞或组织样本在不同温度下加热，使未结合配体的蛋白质变性沉淀，然后利用质谱定量分析每个温度点下可溶蛋白质组的变化，即可在全蛋白质组范围内筛选出热稳定性发生显著改变的蛋白质，这些蛋白即为潜在的药物靶点或下游效应蛋白。 TPP的独特优势在于：1) 无需化合物修饰，可直接使用原始分子进行研究；2) 可在活细胞乃至完整组织中进行，能真实反映细胞内环境的复杂性，包括膜通透性、代谢转化和信号通路扰动；3) 不仅能识别直接靶点，还能通过分析蛋白质丰度、溶解性及复合物共聚集行为的变化，间接揭示药物的作用机制和下游效应。其基本流程包括：样本制备与药物处理、多温度梯度加热、变性蛋白质沉淀分离（通过超速离心、过滤或真空过滤）、可溶蛋白质组提取与消化、肽段的多重同重标记（如使用TMT）、液相色谱-串联质谱分析，以及最终的数据处理与统计分析。
论点三：TPP方法学的重要发展与优化。 自2014年诞生以来，TPP技术在方法学上经历了多项关键改进，极大地扩展了其应用范围和性能： 1. 监测膜蛋白：通过在加热后添加非变性去污剂，成功将TPP的应用扩展到占人类基因组蛋白约27%的膜蛋白，从而能够识别作用于膜受体或转运蛋白的药物靶点（如洋地黄毒苷的靶点ATP合酶）。 2. 二维TPP：将温度梯度和化合物浓度梯度结合在一个质谱实验中，形成了二维热蛋白质组谱分析。这种格式灵敏度更高，能够直接拟合剂量-反应曲线，估算化合物与靶点的亲和力，并能有效区分由热稳定性变化引起的信号与由蛋白质丰度/溶解度变化引起的信号。 3. 高通量与自动化：用台式离心机过滤或真空多孔板过滤替代超速离心，结合96孔板格式和SP3等自动化样品制备方法，使TPP实验通量大幅提升，并能在生物安全柜内安全操作（适用于病原体研究）。 4. 特异性富集与联用技术： * 细胞表面TPP：通过特异性富集质膜蛋白，将可检测的质膜相关蛋白从约160个增加到近800个，显著提升了对G蛋白偶联受体、离子通道等重要药物靶点类别的覆盖。 * 磷酸化-TPP / 热点热分析：将TPP与磷酸化蛋白质组学结合，能够鉴定功能相关的磷酸化位点，因为这些位点的热稳定性变化可能调控蛋白质相互作用。 * 与代谢标记联用：结合SILAC等技术，可以区分新生蛋白与既有蛋白在扰动下的热稳定性变化。 5. 数据解析策略的革新：开发了如非参数响应曲线分析和基于热谱图的配体-蛋白质相互作用检测等高级算法。这些方法不依赖于经典的S形熔解曲线拟合，能更灵敏地检测复杂的热稳定性变化模式，并实现了错误发现率的控制，提高了靶点鉴定的准确性和可靠性。
论点四：TPP应用范围的极大拓展：从细胞系到复杂生物系统。 通过优化裂解和处理方案，TPP的应用已远远超出最初的人类癌细胞系： * 微生物与寄生虫：成功应用于细菌（如大肠杆菌）、酵母、植物、疟原虫、弓形虫等，用于抗生素靶点发现和病原体生物学研究。 * 模式生物：在线虫、果蝇、斑马鱼等模式生物中验证了技术可行性。 * 病毒与宿主互作：用于研究病毒（如巨细胞病毒、SARS-CoV-2）感染对宿主细胞蛋白质热稳定性和蛋白质复合物动态的影响。 * 组织与血液TPP：这是本文强调的最重大进展之一。组织TPP 技术使得能够对经体内或离体给药的完整组织进行分析。这首次实现了在生物体水平、在作用部位直接监测药物的靶点占据情况。例如，文章引用研究，在小鼠不同器官（脾、肝、肾、肺）中成功检测到了组蛋白去乙酰化酶抑制剂帕比司他对HDAC靶点的占据，并发现了组织特异性的脱靶效应（如在肺中发现FADS1）。血液TPP 则提供了从患者血液样本中监测药物靶点占据和发现药效学生物标志物的可能性。
论点五：TPP超越单纯靶点识别的能力——揭示下游生物学效应。 由于TPP在活系统中进行，它不仅能捕捉直接的结合事件，还能全面揭示靶点被调制后引发的蛋白质组状态变化： 1. 监测蛋白质丰度与溶解度变化：例如，在处理后生理温度下（未发生变性）观察到的蛋白质信号变化，反映了其丰度或亚细胞定位的改变，这对于研究蛋白质降解剂（如PROTACs）特别有用。 2. 揭示蛋白质-蛋白质相互作用：基于热邻近共聚集分析原理，即同一复合物中的蛋白质往往呈现相似的热变性曲线。通过TPCA分析，可以推断蛋白质复合物的组成及其在扰动下的动态变化。 3. 推断信号通路扰动：即使直接靶点因丰度过低未检测到热移，其下游效应蛋白（如底物或相互作用蛋白）的热稳定性变化也能间接揭示药物的作用机制。例如，达沙替尼虽未引起其靶点Bcr-Abl的热移，但下游蛋白CRKL的变化揭示了其通路抑制效果。 4. 表征代谢状态与酶活性：研究发现，不同组织中代谢酶的热稳定性差异可能与其底物水平和酶活性相关，为在体表征组织代谢状态提供了新视角。
论点六：TPP技术的未来前景与潜在应用。 文章展望了TPP技术，特别是组织/血液TPP，在未来多个领域的广阔前景： 1. 药物研发的转化应用： * 体内药效学评估：利用血液TPP从患者活检样本中直接监测靶点占据，实现个性化用药指导。 * 系统性毒理学研究：通过多器官组织TPP，全面评估化合物引起的急慢性毒性机制。 * 药物处置研究：利用基因工程动物模型（如敲除药物转运体或代谢酶），研究其对药物在体内分布和靶点占据的影响。 2. 基础生物学与疾病机制研究： * 宿主-病原体互作：在感染动物模型的不同组织中研究病原体感染机制及药物疗效。 * 疾病建模：利用携带疾病相关突变的小鼠模型，研究突变对全身蛋白质组状态和相互作用网络的影响。 * 组织表型分析：绘制不同组织在生理、病理或药物处理下的蛋白质热稳定性图谱，揭示组织特异性的蛋白质相互作用网络和代谢通路活性，深化对生物学基本原理的理解。
三、 论文的意义与价值 本篇综述系统性地总结了TPP这一颠覆性技术自诞生至今的发展脉络，突出强调了其从细胞水平到组织水平应用的飞跃。其核心价值在于： 1. 技术指导价值：为药物化学家、药理学家和蛋白质组学家提供了一份关于TPP技术原理、实验方案、数据分析及最新进展的“全景式”指南，有助于推动该技术在学术和工业界的更广泛应用。 2. 理念引领价值：倡导了一种在完整生物系统、原位研究药物-靶点相互作用的“整体观”研究范式。组织TPP使得在生物体复杂环境下全景式地评估药物处置、靶点占据及下游效应成为可能，这有望加速更安全、更有效药物的开发。 3. 跨学科桥梁作用：TPP将生物物理学（蛋白质热稳定性）、细胞生物学（活细胞环境）和系统生物学（全蛋白质组分析）紧密结合，为解决药物发现中的关键瓶颈问题提供了强大的集成工具，并为基础生物学研究开辟了新的途径。 热蛋白质组谱分析及其在组织中的应用，不仅是一项强大的技术突破，更代表了一种研究范式的转变，正在并将持续为药物靶点识别、作用机制阐明以及复杂生命过程的系统解析做出重要贡献。