本研究的核心作者包括来自中国科学院武汉物理与数学研究所磁共振与原子分子物理实验室的刘迈理（Maili Liu，注：原文中单位为Wuhan Institute of Physics and Mathematics， Chinese Academy of Sciences），来自英国伦敦大学玛丽女王与西田学院化学系的Harold C. Toms与Geoffrey E. Hawkes，以及来自英国帝国理工学院生物化学系的Jeremy K. Nicholson和John C. Lindon（通讯作者）。该研究发表于1999年的《journal of biomolecular nmr》（第13卷，第25-30页）。

本研究属于结构生物学与核磁共振（NMR）波谱学的交叉领域。研究旨在开发一种新的、非侵入性的NMR方法来测定肽和蛋白质中可交换的酰胺NH质子的相对溶剂可及性，从而间接推断其相对交换速率和可能的氢键状态。传统方法，如测量NH质子化学位移的温度依赖性、在不同pH下用D2O进行交换实验，或采用转移饱和、二维EXSY/NOESY等技术，往往需要改变样品条件（如高温、pH变化、氘代），可能带来蛋白质降解、变性或结构改变的风险。因此，寻找一种能在温和条件下获取NH交换信息的方法具有重要意义。此前研究提出，通过测量NH质子的表观扩散系数可以反映其在水和肽两种环境中的相对停留时间。本研究以肽类抗生素紫霉素（Viomycin）为模型体系，旨在验证并展示基于NMR扩散测量法来定量确定NH质子相对寿命的可行性。紫霉素的NMR谱峰已完全归属，且其NH质子相对交换速率已有前期研究数据，是验证新方法的理想模型。

研究的详细工作流程如下。首先，样品制备方面，研究对象为紫霉素（Viomycin），样品由Pfizer Inc.提供。实验样品为浓度50 mM的紫霉素溶液，溶剂为H2O/D2O（90/10， v/v），pH为5.6，此条件下谱图分辨率良好。其次，在NMR数据采集阶段，所有实验均在Bruker AMX-600谱仪上进行（1H观测频率600.13 MHz）。采用了关键的自旋回波脉冲序列变体——纵向涡流延迟序列（longitudinal-eddy-current-delay， LED），该序列是测量扩散系数的标准脉冲场梯度自旋回波实验的改进版，能更有效地减少涡流效应。本研究进一步改进了LED序列，集成了溶剂抑制方案——水峰压制技术（watergate），并使用双极梯度来进一步抑制涡流，从而实现了在不激发水峰的前提下进行高分辨率扩散测量。实验具体参数为：扩散时间Δ为300 ms，使用正弦形状的双极梯度，基础长度2 ms。梯度强度在20 mT/m至700 mT/m范围内以随机顺序变化（步长20 mT/m）。每个梯度强度下采集128次扫描，数据点数为32768，谱宽7204 Hz，温度303 K。第三，数据处理与分析流程为：原始数据通过傅里叶变换处理，并使用Bruker标准谱峰拾取软件获取各NMR信号的强度。对于不参与交换的CH质子，其信号强度随梯度平方的变化遵循单指数衰减公式，据此拟合得到紫霉素分子的整体扩散系数。对于NH质子，由于其在扩散时间内与水发生交换，其信号衰减行为更为复杂。研究采用了公式 (6) 来拟合每个NH峰的强度随梯度平方的衰减曲线。该公式是双指数形式的，反映了在扩散时间内，一部分质子经历了交换（由水扩散系数和肽扩散系数的加权平均值决定其衰减），而另一部分质子未经历交换（仅由肽的扩散系数决定其衰减）。通过双指数最小二乘拟合，可以解出fp，即质子在肽环境中的分数寿命（或称为相对寿命）。其中，水的扩散系数Dw通过单独的未抑制水峰的实验测定，并归一化到已知值。紫霉素的扩散系数Dp通过对12个脂肪族CH共振的拟合值取平均得到。这一分析流程是本研究的核心，它将复杂的交换过程与扩散测量信号联系起来。

研究取得的主要结果如下。通过不同梯度强度下采集的紫霉素1H NMR谱（NH区域，见图2），可以定性地观察到不同NH质子的信号衰减速度存在显著差异。衰减最快的NH3+基团（31，35）的信号在最低梯度下即已消失，表明其交换速度最快。其次是六元环上的NH(6)质子。其余NH质子的衰减速率各有不同。定量分析方面，通过对各个NH峰强度数据进行双指数拟合，成功计算出了每个NH质子在肽上的寿命（见表1）。例如，NH(9)的寿命最长（247 ms），与整个分子的扩散行为相近，表明其溶剂可及性极低，这与之前研究中发现的其参与分子内氢键的结论一致。NH(20)、NH(24)、NH(37)和NH2(15)的寿命也较长，表明这些基团的溶剂可及性受限。相反，NH(6)、NH(8)、NH(13)、NH(16)、NH(27)和NH+2 (7)的寿命较短，表明它们更易与水交换。特别值得注意的是，NH(8)的寿命为33 ms，是已获得寿命数据中除NH(6)（0 ms）外最短的之一。这些结果与之前通过pH变化、饱和转移实验以及二维NOESY实验获得的紫霉素NH质子相对交换速率顺序高度一致。例如，之前NOESY研究得到的交换速率常数（单位s-1）顺序为：NH(8) 1.45 > NH(16) 1.21， NH(13) 1.18 > NH(27) 0.75 > NH2(15) 0.52 > NH(20) 0.44 > NH2+(7) 0.39 > NH(24) 0.13。本研究基于扩散测量得出的寿命顺序（数值小的寿命对应快的交换速率）完全符合这一趋势，从而有力地验证了本方法的可靠性。

研究的结论是，通过使用改进的、集成水峰压制的LED NMR扩散测量方法，并结合双指数拟合模型，成功地在无需改变温度、pH或引入D2O的温和条件下，定量测定了紫霉素中各个NH质子在肽上的相对寿命。该方法直接反映了NH质子在水和肽两种环境中的相对停留时间，从而为评估肽和蛋白质中可交换质子的溶剂可及性以及可能的氢键状态提供了一种全新的、非侵入性的实验手段。其科学价值在于，将扩散排序光谱（DOSY）技术与化学交换理论相结合，拓展了NMR在生物大分子动态结构研究中的应用范围。此方法尤其适用于研究对温度或pH变化敏感的生物分子体系。

本研究的亮点在于：第一，方法学的创新性：创造性地将标准NMR扩散测量序列应用于研究化学交换过程，并建立了适用于“慢交换化学位移但扩散时间内可能发生交换”这一复杂情况的双指数分析模型。第二，实验设计的巧妙性：利用非选择性的一维实验，通过分析单个NH峰的整体衰减行为来同时获取交换与非交换组分的信息，避免了更复杂的二维交换谱实验。第三，验证体系的经典性：选择紫霉素这一谱峰已完全归属、交换性质已有较充分研究的模型肽进行验证，使得新方法得到的结果可以与经典方法直接对比，增强了说服力。第四，应用的普适性与前景：作者指出，该方法可以轻松扩展到三维NMR实验，例如结合1H–15N HMQC或HSQC序列，从而将扩散系数作为第三个维度，用于更复杂的蛋白质体系研究，解决谱峰重叠问题，并直接关联到特定的氮原子位点，具有广阔的应用前景。因此，本研究不仅验证了一种具体的新方法，更重要的是为NMR波谱学在生物大分子溶液动态学研究领域开辟了一条新路径。