本研究的主要作者包括张果芳、赵晶晶、温荣、朱旭萌、刘立波和李春，所有作者均来自中国哈尔滨东北农业大学食品学院的乳品科学重点实验室。这项研究发表于2020年的《Journal of Dairy Science》（JDS）期刊第103卷第11期，具体发表日期为2020年。
本研究的学术领域属于食品科学、微生物学与营养学的交叉领域，具体聚焦于益生菌功能与母乳寡糖（Human Milk Oligosaccharides, HMO）的相互作用。研究的背景基于以下知识：双歧杆菌是母乳喂养婴儿肠道中的优势菌群，其定植对人体健康至关重要，包括调节肠道菌群平衡、促进免疫系统发育、维持黏膜屏障完整性以及抵抗病原体定植等。然而，双歧杆菌发挥这些有益作用的前提是能够粘附于肠道黏膜。此外，已有研究表明，细菌生长所利用的碳源类型会影响其粘附能力以及与肠道上皮细胞的相互作用。母乳寡糖，特别是其中含量丰富的2’-岩藻糖基乳糖（2’-Fucosyllactose, 2’-FL），被认为是促进特定双歧杆菌生长和定植的关键因子。但是，关于双歧杆菌利用2’-岩藻糖基乳糖与其粘附能力之间关系的具体机制，现有知识仍然有限。因此，本研究旨在明确比较2’-岩藻糖基乳糖、低聚半乳糖（Galactooligosaccharides, GOS）和葡萄糖作为碳源，对一株名为Bifidobacterium bifidum DNG6的双歧杆菌的生长特性和粘附特性的影响，并探讨其潜在的分子机制。研究的目标是通过体外实验，阐明特定碳源如何影响细菌的粘附相关基因表达，从而为开发含有特定益生元（如2’-岩藻糖基乳糖）的婴幼儿营养补充剂提供理论依据。
本研究包含详细且系统的实验流程，共分为七个主要步骤，涉及不同的研究对象和处理方法。
步骤一：菌株培养与生长特性分析。 研究对象为从成人粪便中分离得到的Bifidobacterium bifidum DNG6菌株，以及作为参照菌株的Bifidobacterium animalis ssp. lactis BB12。DNG6菌株被分别接种到以2%（wt/vol）葡萄糖、GOS或2’-岩藻糖基乳糖作为唯一碳源的改良MRS培养基中。在37°C厌氧条件下培养36小时，期间每隔2小时使用分光光度计在600 nm波长下测量培养液的光密度（OD600），绘制生长曲线。此步骤旨在评估不同碳源对细菌基础生长能力的影响。实验设置了三个独立的生物学重复和技术重复。
步骤二：细菌表面特性测定。 本步骤研究了在不同碳源中生长后的DNG6菌株的自聚集能力和表面疏水性。自聚集实验将细菌悬浮液调整至统一OD值后，在室温下静置5小时，测量上清液光密度的变化，计算自聚集率。表面疏水性测定采用细菌粘附烃法，将细菌悬浮液与二甲苯混合，涡旋后静置分层，通过测量水相光密度的减少来计算细菌对烃类的亲和力，即疏水性百分比。这两个实验是评估细菌粘附潜力的常用体外指标，每个实验均进行了三次独立重复。
步骤三：体外粘附实验。 本步骤的核心是使用人结肠腺癌细胞系Caco-2细胞作为肠道上皮细胞的体外模型。Caco-2细胞在培养皿中生长至融合后分化形成单层。将步骤一中在不同碳源培养基中生长的DNG6和BB12菌株的细胞收集、洗涤，并用荧光染料CFDA-SE进行标记。然后将标记的细菌与Caco-2细胞单层共孵育2小时。孵育后，洗去未粘附的细菌，用胰蛋白酶处理将粘附的细菌从细胞上释放出来，最后通过荧光分光光度计测量荧光强度。粘附率通过“粘附细菌的荧光强度 / 初始细菌悬浮液的荧光强度 × 100%”的公式计算得出。该实验直接量化了细菌对肠道上皮细胞的粘附能力，每个处理组进行了三次独立实验。
步骤四：化学处理对粘附的影响。 为了探究细菌细胞表面何种成分介导了粘附，研究者对在葡萄糖培养基中生长的DNG6菌株进行了四种不同的化学处理：用氯化锂（LiCl）或蛋白酶K（Proteinase K）处理以去除或降解表面蛋白；用过碘酸钠（NaIO4）处理以氧化表面碳水化合物；用苯酚（PhOH）处理以去除磷壁酸。处理后的细菌与未处理的对照组细菌一起，按照步骤三的方法进行粘附实验。通过比较处理组与对照组的粘附率变化，可以推断出参与粘附过程的关键表面分子。同时，研究者还使用透射电子显微镜观察了LiCl处理前后细菌细胞表面的形态变化，直观地展示了表面蛋白层的去除效果。
步骤五：粘附相关基因表达分析。 为了从分子层面解释不同碳源对粘附能力影响的机制，研究者采用了逆转录实时定量PCR技术。实验设计为：将在不同碳源（葡萄糖、GOS、2’-岩藻糖基乳糖）中生长的DNG6菌株分别与Caco-2细胞共孵育2小时，同时设置不与Caco-2细胞共孵育的平行组作为对照。孵育结束后，收集共培养体系中的细菌细胞，提取总RNA并逆转录为cDNA。通过实时定量PCR检测了四个与粘附相关的基因的表达水平：转醛醇酶基因、烯醇酶基因、伴侣蛋白GroEL基因和延伸因子EF-Tu基因。以16S rRNA基因作为内参基因进行表达量标准化。数据分析采用2−ΔΔCt方法，计算相对于无细胞共孵育对照组的基因表达倍数变化。该步骤旨在揭示与宿主细胞接触时，不同碳源如何调控细菌粘附相关因子的基因表达。
步骤六：数据分析方法。 本研究中所有定量数据均以三次独立实验的平均值±标准差表示。使用Student’s t检验或单因素方差分析进行组间差异的统计学显著性检验，P值小于0.05被认为具有统计学差异。图表中通常用不同字母标注具有显著差异的组别。
步骤七：研究中涉及的试剂与仪器。 研究中使用了商业化的标准试剂，如2’-岩藻糖基乳糖购自上海公司，GOS和葡萄糖购自Sigma-Aldrich。关键仪器包括厌氧培养箱、分光光度计、荧光分光光度计和透射电子显微镜等。实验方法均为该领域常规方法，未涉及特别新颖或自创的实验设备、软件或算法。其工作流程的核心在于系统性地结合了表型观察（生长、粘附）、化学干预和基因表达分析，以构建从现象到机制的完整证据链。
本研究的主要结果如下：
首先，关于生长特性。 B. bifidum DNG6菌株能够利用2’-岩藻糖基乳糖作为碳源生长，但其生长模式与在葡萄糖和GOS中不同。具体数据显示，在2’-岩藻糖基乳糖中生长的菌株，其延滞期长达12小时，显著长于葡萄糖组的4小时和GOS组的6小时。进入稳定期后，2’-岩藻糖基乳糖组的最大光密度值约为1.3，也显著低于葡萄糖组的1.7和GOS组的1.5。这表明2’-岩藻糖基乳糖的结构更为复杂，DNG6菌株需要更长时间启动其代谢系统进行利用，且最终菌体产量较低。
其次，关于自聚集和疏水性。 在三种碳源中生长的DNG6菌株，其自聚集率和表面疏水性百分比在数值上虽有差异（例如，2’-岩藻糖基乳糖组的自聚集率和疏水性均略高），但统计结果显示这些差异并不显著。这一结果意味着，在本研究体系中，这两种非特异性的表面物理化学特性可能不是导致后续粘附能力差异的主要决定因素。
第三，关于粘附能力。 粘附实验得到了明确且关键的结果。以葡萄糖为碳源时，DNG6菌株对Caco-2细胞的粘附率为7.08%，与参照菌株BB12的6.53%无显著差异。然而，碳源类型显著影响了DNG6的粘附能力。在2’-岩藻糖基乳糖中生长的DNG6菌株表现出最高的粘附率，达到9.34%，显著高于在GOS中生长的6.64%和在葡萄糖中生长的7.08%。这一直接证据表明，2’-岩藻糖基乳糖作为一种碳源，能够特异性地增强B. bifidum DNG6对肠道上皮细胞的粘附能力。
第四，关于化学处理的影响。 化学处理实验为粘附的分子基础提供了重要线索。所有四种处理均显著降低了DNG6菌株的粘附能力，证实了细胞表面分子在粘附中的关键作用。其中，LiCl和蛋白酶K处理使粘附率分别下降了62.92%和58.96%，抑制作用最为强烈，这强力提示表面蛋白是DNG6菌株粘附的主要介质。透射电镜观察结果支持了这一结论：未经处理的细菌细胞表面粗糙，可见外表面层；而经LiCl处理后，细胞表面变得光滑，表明表面蛋白被有效去除。此外，苯酚处理（针对磷壁酸）使粘附率下降48.38%，过碘酸钠处理（针对碳水化合物）使粘附率下降27.34%，说明磷壁酸和碳水化合物也部分参与了粘附过程，但其重要性可能低于表面蛋白。
第五，关于基因表达。 基因表达分析结果从转录水平揭示了2’-岩藻糖基乳糖增强粘附的潜在机制。首先，与Caco-2细胞共孵育后，无论生长在何种碳源中，DNG6菌株的四个粘附相关基因的表达水平均显著上调，这表明这些基因确实响应了与宿主细胞的接触，可能直接参与粘附过程。最关键的结果在于碳源间的比较：在2’-岩藻糖基乳糖中生长的DNG6菌株，在与Caco-2细胞接触后，其转醛醇酶、烯醇酶、GroEL和EF-Tu基因的表达上调幅度均显著高于在GOS和葡萄糖中生长的菌株。其中，转醛醇酶基因的表达上调了15.2倍，增幅最大。这些基因编码的蛋白质已被多项前期研究证实位于双歧杆菌细胞表面，并可作为粘附素或粘附相关因子发挥作用。因此，该结果意味着2’-岩藻糖基乳糖不仅作为碳源被利用，还可能作为一种信号分子，在细菌与宿主细胞接触时，更有效地触发和上调一系列粘附相关蛋白的编码基因表达，从而增强细菌的粘附能力。这一发现将碳源利用与粘附的分子调控机制直接联系了起来。
本研究的结论清晰而明确：2’-岩藻糖基乳糖作为碳源，能够显著增强Bifidobacterium bifidum DNG6菌株对Caco-2肠道上皮细胞的体外粘附能力。这种增强作用并非主要通过改变细菌的自聚集或疏水性等一般表面特性来实现，而是与粘附相关基因（如转醛醇酶、烯醇酶、GroEL和EF-Tu基因）的高水平表达密切相关。化学处理实验进一步确认了表面蛋白在粘附过程中的核心作用。
本研究具有重要的科学价值和应用价值。在科学价值方面，它深化了对母乳寡糖功能的理解，从“促进特定菌群生长”延伸到“调控特定菌群的定植能力”，揭示了碳源类型通过影响基因表达来调控细菌-宿主相互作用的分子机制，为微生物-宿主互作领域提供了新的见解。在应用价值方面，研究结果直接支持了2’-岩藻糖基乳糖作为一种高效益生元应用于婴幼儿配方奶粉或营养补充剂的潜力。通过选择2’-岩藻糖基乳糖这样的特定益生元，可以更精准地促进有益双歧杆菌的定植和持久性，从而更好地模拟母乳喂养的益处，支持婴儿肠道健康及免疫系统的发育。研究也为设计更有效的合生元产品（益生菌与益生元的组合）提供了理论指导，即选择能够协同增强益生菌粘附与定植能力的特定益生元成分。
本研究的亮点包括：第一，重要的研究发现：明确证明了2’-岩藻糖基乳糖相较于常见的GOS和葡萄糖，在增强B. bifidum特定菌株粘附能力方面的独特优势，并首次在该菌株中系统地将这种表型变化与多个粘附相关基因的上调表达相关联。第二，研究方法的系统性：工作流程设计严谨，从表型到机制层层深入，依次评估了生长、表面物理特性、粘附能力、关键表面分子成分和基因表达，构成了完整的证据链。第三，研究对象的针对性：研究聚焦于从成人分离的B. bifidum菌株，扩展了母乳寡糖对非婴儿源双歧杆菌功能调控的认识，暗示了2’-岩藻糖基乳糖在更广泛年龄群体中的应用可能。
此外，研究中还有一些有价值的讨论点。作者指出，体外Caco-2细胞模型虽然被广泛使用，但不能完全模拟体内复杂的肠道环境，特别是黏液层和肠道菌群共存的影响。因此，他们建议未来需要开展动物实验或更复杂的体外模型（如黏液层模型）来验证这些体外发现。同时，当前研究主要在基因表达水平，后续需要在蛋白质水平（例如通过蛋白质组学或表面蛋白组学）进一步鉴定和确认具体是哪些表面蛋白在2’-岩藻糖基乳糖的诱导下发挥关键粘附作用，以更精确地阐明分子机制。这些讨论为未来的研究方向提供了清晰的思路。