基于枯草芽孢杆菌与嗜酸乳杆菌混菌发酵技术提升金银花-决明子生物活性及功能性的研究学术报告
一、 研究团队与发表信息
本研究由周梦天（第一作者，北京农学院食品科学与工程学院硕士研究生）、马涛（天津科技大学食品科学与工程学院、食品营养与安全国家重点实验室、天津市食品质量与健康重点实验室及未名太研生物科技(绍兴)有限公司）、黄永祺、刘昭雪以及魏颖（通信作者，北京农学院食品科学与工程学院）共同完成。该研究以题为“混菌发酵技术提升金银花-决明子生物活性及其功能性研究”的论文形式，发表于《食品科技》（Food Science and Technology）期刊2025年第50卷第07期。
二、 学术背景与研究目的
本研究属于食品科学与工程领域，具体聚焦于功能性食品开发、中药/药食同源资源生物转化及微生物发酵技术应用方向。研究背景源于金银花和决明子作为传统“药食同源”草药，富含黄酮、多糖、皂苷等多种活性成分，具有清热解毒、养肝明目等功效，常被用于开发草本饮品。然而，传统的热水煎煮提取法存在明显局限：植物致密的细胞壁结构阻碍了活性成分的充分溶出，导致提取率低、生物利用度不高；同时，提取液往往带有苦味和涩味，适口性差，影响了产品的市场接受度。此外，传统提取工艺产生的大量中草药残渣也造成了资源浪费。
近年来，微生物发酵技术被证明是提升中草药活性成分释放、转化大分子物质、改善风味及降低潜在毒副作用的有效手段。例如，已有研究显示发酵能显著提升黄芪多糖、人参皂苷的含量及生物活性。基于此，本研究旨在探索一种创新的混菌发酵策略，以克服传统方法的不足。研究团队选择了两种具有互补功能的菌株：枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)，因其能产纤维素酶等，可有效裂解植物细胞壁，促进内容物释放；以及嗜酸乳杆菌 (Lactobacillus acidophilus)，一种常用于食品发酵的乳酸菌，以其改善食品风味和口感的能力著称。前期研究提示，这两种菌可能存在协同作用。
因此，本研究的具体目标为：1) 利用枯草芽孢杆菌的酶系破坏金银花-决明子的细胞结构，最大化释放活性物质；2) 通过微生物代谢将释放的大分子活性成分转化为更易吸收的小分子形式，提高生物利用度；3) 借助嗜酸乳杆菌的发酵作用，改善终产品的风味和口感，提升适口性；4) 通过优化发酵工艺参数，获得生物活性高、感官品质佳的金银花-决明子发酵液，为其功能性食品的开发提供科学依据和工艺指导。
三、 详细研究流程与方法
本研究采用了系统的实验设计，包括菌种活化、单因素试验、相关性分析、正交试验优化以及最终工艺验证与效果评价。具体流程如下：
1. 材料准备与菌种活化： 研究选用湖南隆回产金银花和宁夏产决明子为原料，经粉碎过60目筛后混合。实验菌株为枯草芽孢杆菌和嗜酸乳杆菌。首先将冻存菌种分别接种于LB液体培养基和MRS液体培养基中，于37°C、180 rpm条件下进行活化培养。每24小时传代一次，取第三代菌液，经离心洗涤后，用生理盐水重悬制成菌悬液备用，并按照国标方法进行活菌计数。
2. 发酵液制备基础流程： 将金银花-决明子混合粉末按预设的料液比加入去离子水，进行酶解预处理：加入原料质量3%的果胶酶和纤维素酶溶液，调节pH至7.5，于65°C恒温水浴中酶解特定时间。酶解液冷却后，按预设的发酵菌株比例（枯草芽孢杆菌:嗜酸乳杆菌） 接种菌悬液，置于37°C、180 rpm的摇床中进行发酵，持续特定的发酵时间。发酵结束后，样品用于后续指标测定。
3. 单因素优化试验： 为探究各关键工艺参数对发酵效果的影响，研究设计了四组单因素试验，每组设置不同水平，以总黄酮含量、总多糖含量、总皂苷含量和感官评分为评价指标。试验在控制其他因素固定的条件下，逐一考察以下因素： * 发酵菌株接菌比例：设置枯草芽孢杆菌:嗜酸乳杆菌为3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3 (cfu:cfu)。 * 料液比：设置1:100, 1:40, 1:20, 1:15, 1:10 (g/ml)。 * 酶解时间：设置1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5 (小时)。 * 发酵时间：设置1, 2, 3, 4, 5, 6 (天)。 每组试验均设置3次重复，以确定各因素的初步优选范围。
4. 指标检测方法： * 活性成分含量测定：采用标准曲线法。总黄酮含量参照芦丁标准品，采用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠比色法于510 nm测定。总多糖含量参照葡萄糖标准品，采用苯酚-硫酸法于490 nm测定。总皂苷含量参照熊果酸标准品，采用香草醛-冰醋酸-高氯酸显色法于477 nm测定。 * 感官评价：由15名女性和10名男性组成的评价小组，从组织形态（30分）、色泽（20分）、气味（30分）、口感（20分）四个维度对发酵液进行百分制评分，取平均分为最终感官评分。 * 残渣利用率计算：发酵前后分别测定原料干质量（m1）和发酵残渣干质量（m2），按公式(残渣利用率 = (m1 - m2) / m1 × 100%) 计算。 * DPPH自由基清除率测定：用于评价发酵液的体外抗氧化活性。 * 综合评分计算：为平衡多项指标进行工艺优化，研究引入了综合评分体系。首先对单因素试验结果进行Pearson相关性分析，以确定各指标（总黄酮、总多糖、总皂苷、感官评分）与工艺参数间的关联强度。分析结果显示，总黄酮含量和感官评分受工艺参数影响更为显著。因此，在计算综合评分时，为这四个指标赋予了不同的权重：总黄酮:总多糖:总皂苷:感官评分 = 3:2:2:3。各指标的分数通过极差归一化公式计算（如总黄酮分数 = (x - x_min) / (x_max - x_min) × 100），总多糖因含量在优化中期望降低，故采用反向计算。最后加权求和得到综合评分。
5. 正交试验设计与优化： 在单因素试验确定的各因素较优水平附近，选取发酵菌株比例(A)、料液比(B)、酶解时间©、发酵时间(D)四个因素，每个因素设三个水平，采用L9(3^4)正交表安排试验。以综合评分为响应值，通过极差分析确定各因素的主次影响顺序及理论上的最优工艺组合。
6. 验证试验与对照比较： 对正交试验得出的最优工艺组合进行验证试验。同时，以传统水煎法（即不经过酶解和微生物发酵，仅热水提取）制备的金银花-决明子水提取物作为对照组。对比两组在活性成分含量、感官评分、残渣利用率及DPPH自由基清除率上的差异，以验证混菌发酵工艺的优越性。
7. 数据分析： 所有试验数据均以均值±标准差表示，采用IBM SPSS 22.0软件进行单因素方差分析(ANOVA)，显著性水平设为p<0.05。使用Origin 2022软件绘图。
四、 主要研究结果与分析
1. 单因素试验结果揭示了关键工艺参数的影响规律： * 接菌比例：当枯草芽孢杆菌与嗜酸乳杆菌比例为2:1时，发酵液的总黄酮含量(113.33 mg/L)和感官评分(85.67分)达到峰值。这表明该比例下，枯草芽孢杆菌的细胞壁裂解作用与嗜酸乳杆菌的风味改善作用达到了最佳协同。总皂苷含量在比例3:1时最高，而总多糖含量在比例2:1时最低，说明不同菌株比例对不同成分的代谢影响存在差异。 * 料液比：料液比为1:40 (g/ml)时，总黄酮和总皂苷含量均显著高于其他比例，分别为120.00 mg/L和2059.00 mg/L。过高的溶剂比例（如1:100）可能稀释了底物浓度，影响微生物代谢效率；而过低的溶剂比例（如1:10）则可能限制了传质和成分溶出。感官评分在料液比1:100时最高，但综合考虑活性成分得率，1:40是更优选择。 * 酶解时间：酶解时间为2.0小时时，总黄酮、总多糖和总皂苷含量均达到峰值。酶解时间过短，细胞壁破坏不充分；时间过长，可能因长时间加热导致部分热敏性成分降解或酶失活。 * 发酵时间：随着发酵时间延长，总黄酮含量总体呈上升趋势，在第5天达到115.33 mg/L；总皂苷含量在第4天达到峰值2039.33 mg/L；而总多糖含量则在前几天急剧下降后趋于平缓，表明微生物可能利用了部分多糖作为碳源。感官评分在第4天达到最高(87.67分)，之后可能因过度发酵产生不良风味而略有下降。 * 菌群协同效应：研究还发现，在混菌发酵体系中，枯草芽孢杆菌的存在能将嗜酸乳杆菌的活菌数从6.90 lg CFU/mL显著提升至8.09 lg CFU/mL (p<0.05)，证实了枯草芽孢杆菌通过分解大分子物质为乳酸菌提供了更丰富的营养，促进了其生长，这是一种积极的微生物互作。
2. 相关性分析与综合评分指导工艺优化： Pearson相关性分析表明，总黄酮含量与发酵时间呈显著正相关，与料液比呈显著负相关；感官评分与料液比呈极显著负相关。这为权重分配提供了依据。基于单因素试验结果的综合评分分析，初步确定了各因素的较优点：接菌比例2:1、料液比1:40、酶解时间2.0 h、发酵时间4 d。
3. 正交试验确定最优工艺参数： L9(3^4)正交试验及极差分析显示，四个因素对综合评分（即整体发酵效果）的影响主次顺序为：料液比 (B) > 发酵时间 (D) > 接菌比例 (A) > 酶解时间 ©。通过计算各因素水平下的平均综合评分（K值），得出理论最优工艺组合为：A2B2C1D1，即发酵菌株比例（枯草芽孢杆菌:嗜酸乳杆菌）2:1、料液比1:40 g/ml、酶解时间1.5小时、发酵时间3天。此组合不在已进行的9组正交试验中。
4. 验证试验证实最优工艺的卓越效果： 对A2B2C1D1工艺进行验证，结果显著优于正交表中任何一组。与传统水煎法对照组相比，该优化工艺生产的金银花-决明子发酵液呈现出全面的提升： * 活性成分：总黄酮含量达到(132.44 ± 1.53) mg/L，比传统水煎法提升了322.69%；总皂苷含量达到(1611.61 ± 40.36) mg/L，提升了126.35%。总多糖含量为(1020.94 ± 9.12) mg/L，降低了39.52%，这可能与微生物利用多糖作为碳源有关，但转化成了其他活性物质或代谢产物。 * 感官品质：感官评分高达(93.00 ± 1.63)分，提升了62.21%，表明发酵极大地改善了产品的组织形态、色泽、气味和口感。 * 资源利用率与抗氧化活性：残渣利用率显著提高，意味着42%的原料残渣被微生物转化为了可溶性物质，减少了浪费。更重要的是，发酵液的DPPH自由基清除率提升了43.79%，表明其体外抗氧化能力得到显著增强。
五、 研究结论与价值
本研究成功开发并优化了一种利用枯草芽孢杆菌和嗜酸乳杆菌进行混菌发酵制备高活性、高适口性金银花-决明子发酵液的新工艺。确定的最佳工艺参数为：菌种比例（枯草芽孢杆菌:嗜酸乳杆菌）2:1，料液比1:40 g/ml，酶解时间1.5小时，发酵时间3天。
该研究的科学价值在于：1) 实证了枯草芽孢杆菌与嗜酸乳杆菌在发酵药食同源植物体系中的协同作用机制，即前者通过酶解作用破坏细胞壁并促进后者生长，后者则改善风味并可能参与活性成分的转化。2) 通过系统的单因素、相关性分析和正交试验，建立了针对该特定体系的、以多指标加权综合评分为导向的工艺优化方法学。3) 揭示了混菌发酵不仅能大幅提高黄酮、皂苷等特定活性成分的溶出和转化率，还能整体提升体系的抗氧化活性，这为理解微生物发酵对复杂植物体系化学成分和生物活性的影响提供了新的案例。
其应用价值显著：1) 提供了一种远超传统水煎法效率的金银花-决明子资源深加工技术，为开发具有增强保健功能（如抗氧化）的草本饮料、功能性食品或食品配料指明了方向。2) 工艺有效改善了产品的感官品质，解决了传统提取液口感不佳的痛点，提高了市场潜力。3) 通过提高原料利用率（减少42%残渣），符合绿色制造和可持续发展理念，具有经济效益和环境效益。
六、 研究亮点
七、 其他有价值的内容
研究在讨论部分引用并对比了多项相关研究，如枯草芽孢杆菌发酵提升黄芪渣营养价值、乳酸菌发酵改善陈皮抗氧化活性等，将本研究置于更广阔的学术背景中，说明了所用方法的合理性与结果的可靠性。同时，论文在结论部分展望了未来研究方向，包括深入探究发酵产物的体内代谢机制、吸收特性以及在特定疾病模型中的应用潜力，体现了研究的延续性和深度。