肿瘤类器官生物样本库绘制癌症基因依赖性图谱
主要作者与机构
本研究由Wellcome Sanger Institute的H. E. Francies与M. J. Garnett作为通讯作者主导完成，第一作者为C. Herranz-Ors。研究联合了英国五家临床中心（伯明翰、剑桥、格拉斯哥、伦敦和南安普顿）以及欧洲分子生物学实验室欧洲生物信息学研究所（EMBL-EBI）等多家机构，作为人类癌症模型倡议（HCMI）的组成部分。论文发表于*Nature*期刊，于2026年6月19日接收，在线发表于2026年。
研究背景
癌细胞系（cancer cell lines）长期以来是癌症研究和药物发现的基础工具，但其存在无法全面捕捉肿瘤多样性、缺乏患者关联的临床背景以及体外培养适应性改变等局限。肿瘤类器官（tumour organoids）作为源自患者组织的三维培养体系，能够更好地保留肿瘤的组织学、遗传学和功能特征，是细胞系的有力补充。然而，现有类器官生物样本库规模较小（最大的两个学术库分别仅含115和96个模型），多数缺乏全面的基因组注释，部分仅能短期培养而无法冻存复苏，且伦理审批限制导致可及性不足。更为关键的是，尚不明确大规模、异质性类器官库能否支撑系统性的癌症依赖性图谱构建。
本研究旨在建立包含256个临床注释的肿瘤类器官生物样本库，覆盖结直肠腺癌（COAD/READ）、食管腺癌（ESCA）、卵巢癌（OV）、胰腺腺癌（PAAD）和胃腺癌（STAD）五种癌症类型，并通过全基因组测序、转录组测序和基因组范围的CRISPR–Cas9筛选，系统绘制癌症基因依赖性图谱，以推动精准肿瘤学发展。
研究流程
研究采用了多阶段的系统化工作流程。第一阶段是样本采集与类器官建库。研究团队建立了五个临床站点的协作网络，从2016年5月至2023年11月收集手术切除或活检的新鲜肿瘤组织，同时采集胚系参考正常样本（血液或正常组织）。样本在Wellcome Sanger Institute的单一中心化设施中统一处理，使用标准化操作流程以最大限度减少批次差异。建库成功的严格标准包括：扩增至超过2500万细胞、建立25支冻存管、通过冻融质量控制（复苏后能连续传代四代）、以及单核苷酸多态性（SNP）与原始肿瘤匹配。最终从907份样本（来自878位供者）中成功建立256个类器官，总成功率为28%。若排除低细胞含量样本并将短期培养纳入考量，调整后的成功率可达65%，与既往研究相当。值得注意的是，早期传代和冻存时间过早竟然与建库失败相关，这可能归因于非肿瘤细胞的优势生长。
第二阶段为基因组与转录组表征。所有256个类器官均完成了全基因组测序（平均覆盖深度38×），其中171个有配对的肿瘤组织测序数据。同时对所有类器官进行了RNA-seq。分析流程涵盖单核苷酸变异（SNVs）、插入缺失突变（indels）、结构变异（SVs）、体细胞拷贝数改变（SCNAs）、突变特征（mutational signatures）、染色体碎裂（chromothripsis）和全基因组复制（WGD）事件的鉴定。驱动基因事件注释整合了IntOGen、COSMIC、MSKCC和癌症易感变异四个数据源，涉及783个癌症驱动基因。突变特征提取使用SigProfilerExtractor和SigProfilerAssignment，同源重组缺陷（HRD）评估使用CHORD工具。结直肠癌类器官进一步通过转录组数据进行了共识分子亚型（CMS 1–4）和结直肠癌内在亚型（CRIS A–E）分类。
第三阶段为CRISPR–Cas9功能基因组筛选。研究团队开发了可扩展的筛选平台，采用5%基底膜提取物-2（BME-2）悬浮培养体系以简化三维培养条件下的操作。筛选主要使用最小基因组范围CRISPR–Cas9文库（MinLibCas9），部分模型同时使用更大的Yusa v1.1文库进行交叉验证。最终在162个类器官上完成了质量合格的CRISPR筛选（85例COAD/READ、59例ESCA、11例OV、4例PAAD和3例STAD），总体成功率为85%。数据使用BAGEL2方法鉴定适应度基因（fitness genes），使用ADaM模型定义核心适应度基因（core fitness genes）。差异依赖性分析采用线性回归模型，将基因敲除的log fold change值与基因组、患者和临床特征相关联。
第四阶段为药理学验证。针对EGFR–RAS–MAPK通路，对21个结直肠癌类器官（17个KRAS突变型、4个野生型）进行了药物敏感性分析，测试了pan-RAS抑制剂（RMC-6236、RMC-7977）、pan-KRAS(off)抑制剂（BI-2865）、KRAS降解剂（ACBI3）、等位基因特异性抑制剂（sotorasib针对G12C、MRTX1133针对G12D）以及EGFR抑制剂（afatinib、gefitinib）。此外，对配对的前后治疗食管癌类器官进行了差异药物敏感性验证。
主要结果
类器官与配对肿瘤的基因组保真度分析显示高度一致性。突变负荷的Pearson相关系数（PCC）为0.786，结构变异数为0.823，克隆分数为0.92。76对（44%）样本共享超过75%的体细胞突变，SCNA全基因组轮廓的中位PCC为0.78，142对（83%）达到PCC≥0.5。值得注意的是，类器官中的肿瘤纯度更高（几乎全部超过0.95），且染色体碎裂和WGD的检出率高于肿瘤组织，表明培养过程中的克隆纯化使类器官在检测基因组改变方面具有更高灵敏度。此外，与HCMI的独立遗传分析比对显示了高度一致性，验证了结果的稳健性和互操作性。
在驱动基因图谱方面，类器官忠实地再现了谱系特异性的癌症驱动事件。COAD/READ-MSI模型几乎均为二倍体且具有高突变负荷，OV类器官具有最高的WGD和染色体碎裂频率。生物样本库涵盖了稀有但临床重要的基因型组合，包括94个KRAS改变的类器官。突变特征分析揭示了与疾病病因学的关联：所有MSI模型均携带错配修复缺陷相关特征；SBS88（colibactin诱导）在10个COAD/READ-MSS类器官中检出，其中3例来自早发性结直肠癌患者（占50岁以下患者的27%），9/10来自远端或直肠肿瘤；SBS3（HRD相关）在6个类器官中检出；SBS35（铂类治疗相关）仅出现在接受过铂类化疗的患者样本中。
CRISPR筛选结果在质量上达到了与细胞系相当的水平（AUROC=0.97，AUPR=0.973）。共鉴定出654个共享核心适应度基因和97个类器官特有的核心适应度基因。类器官特有核心基因显著富集于类固醇生物合成通路（最显著：类固醇生物合成过程，p=1.38×10⁻⁶）。通过整合群体尺度的遗传约束数据，发现核心适应度基因富集于高约束基因类别。基因-生物标志物关联分析在胃肠道类器官中鉴定出7,086个差异依赖基因。具体而言：WRN依赖性在COAD/READ中与RNF43突变、RPL22或SETD1B突变以及SBS44特征相关（效应值=-0.747至-0.823）；值得注意的是，4个MSI类器官不依赖WRN，且缺乏与WRN依赖相关的TA二核苷酸重复扩增；MDM2依赖性对TP53野生型类器官及KRAS^G12D类器官（效应值=0.463和-0.576）显著；在ESCA中，CCNE1扩增与CCNE1依赖性相关（效应值=-0.645，调整p=3.65×10⁻⁵）。
EGFR–RAS–MAPK通路的系统分析揭示了等位基因特异性的差异依赖模式。KRAS突变类器官对KRAS的依赖性显著高于野生型，而KRAS野生型类器官对EGFR和PTPN11的依赖性更高。尤为重要的是，KRAS^G12X变体类器官表现出最强的KRAS依赖性，同时对EGFR和PTPN11的依赖性也高于其他KRAS突变型。药理学验证显示，所有类器官对pan-RAS(on)抑制剂高度敏感（平均IC₅₀=0.023–0.042μM），但不同作用机制的RAS抑制剂敏感性差异显著。KRAS^G12X和野生型类器官对EGFR抑制剂afatinib和gefitinib的敏感性显著高于非G12 KRAS变体。KRAS^Q61H类器官对EGFR抑制完全无应答，且在EGF撤除后细胞活力无变化，表明Q61H变体不依赖上游EGFR信号传导，而G12X变体保留了这种依赖性。
患者配对前后治疗样本的功能比较揭示了治疗驱动的肿瘤演化。在一对ESCA类器官（化疗前与复发后）中，KRAS扩增在两者中均保留，但MYC扩增仅存在于治疗前样本，复发后消失。相应地，MYC依赖性在治疗后类器官中降低。差异依赖性分析鉴定了几个可药物化靶点的变化：治疗后类器官对KRAS和DNMT1的依赖性降低，对蛋白酶体核心亚基PSMB5的依赖性升高。这些预测均通过药物敏感性实验得到验证——治疗后类器官对pan-RAS抑制剂和DNMT1抑制剂的敏感性降低，对蛋白酶体抑制剂（bortezomib和ixazomib）的敏感性升高，且这种差异具有靶点特异性（TOP2A依赖性和依托泊苷敏感性无差异）。
结论与意义
本研究建立了目前最大规模之一的高注释可再生肿瘤类器官生物样本库，证明在大规模、异质性类器官队列中进行系统性的CRISPR依赖性图谱构建是可行的，且数据质量可与细胞系相媲美。该资源弥合了基因组描述与功能理解之间的鸿沟，为精准肿瘤学提供了从描述性基因组学迈向多尺度整合功能图谱的关键基础设施。类器官已被存入公共数据库（ATCC和EMD Millipore）分发，所有基因组和功能数据可通过Cell Model Passports和DepMap Miner门户公开访问。研究展示了类器官在捕获罕见基因型、解析等位基因特异性药物反应、追踪治疗耐药演化等方面的独特价值，为下一代功能化癌症图谱的构建奠定了重要基础。
研究亮点
本研究的突出贡献体现在以下方面：第一，首次在如此大规模的类器官队列（162个模型）上完成全基因组CRISPR筛选，克服了三维培养体系在筛选通量和操作复杂度上的技术壁垒；第二，通过整合群体遗传约束数据与实验性核心适应度基因，提供了一种正交验证靶点耐受性的方法学创新；第三，利用配对前后治疗样本的功能基因组比较，直接追踪了化疗选择性压力下的肿瘤克隆演化和依赖性重塑，为治疗难治性疾病的药物重定位提供了新策略；第四，对KRAS等位基因特异性EGFR依赖性的揭示为临床中KRAS G12X和Q61X变体的差异化治疗策略提供了机制基础。