本文介绍了一项名为 malva 的新型计算平台，该平台首次实现了在单细胞分辨率下对原始RNA测序数据进行超快速、无需参考基因组的序列搜索与分析。这项研究由 Daniel León-Periñán、Nikos Karaiskos 和 Nikolaus Rajewsky 等人完成，他们来自柏林医学系统生物学研究所（MDC-BIMSB）等机构。论文于2026年8月26日在线发表在 nature 杂志上。

研究背景与目标

单细胞及空间转录组学技术每年产生海量的RNA测序数据，但现有数据分析流程普遍依赖参考基因组比对，仅保留基因或转录本的计数信息，丢失了大量关键的序列级信息，如突变、剪接异构体、病原体序列等。同时，现有的序列搜索工具（如BLAST、metagraph等）虽能快速检索序列，但无法处理单细胞级别的海量数据，因为其索引构建需要巨大的内存和计算资源。研究团队开发malva的目的，正是为了打破这一瓶颈，使研究人员能够像使用搜索引擎一样，在数秒内于数百万个细胞中查询任意RNA序列，而无需下载和处理原始数据。

malva平台的工作流程

malva平台包含三个核心组件：一个序列搜索算法、一个持续扩展的可搜索语料库（malva index）以及一个公共应用程序编程接口（API）。其工作流程可分为索引构建、查询处理和无参考分析三个主要阶段。

在索引构建阶段，malva首先从公共数据库（如人类细胞图谱HCA、NCBI SRA、GEO、ENA等）持续抓取单细胞RNA测序的原始FASTQ文件。随后，平台对数据进行标准化处理：提取细胞条形码，并与技术特异性的白名单进行精确匹配以识别真实细胞；将每个测序读段分解为长度为k的非重叠k-mer（默认k=24），并将这些k-mer与来源细胞的条形码关联存储。malva在索引设计上采用了三项关键创新：非重叠k-mer采样避免了构建de Bruijn图的高昂计算成本；每个k-mer的稀疏倒排列表仅存储表达该k-mer的细胞标识符，使查询成本与索引总规模解耦；独立的样本级索引与增量合并策略支持磁盘布局下的内存高效查询和语料库的持续扩展。索引在构建时对k-mer进行排序和去重，采用两层结构（序列数组和位置数组）实现快速查找，并通过前缀表进行磁盘分区管理。整个malva index目前包含约7400万个细胞，来自数千个实验，覆盖人类和小鼠样本，存储足迹不到源文件的10%。

在查询处理阶段，用户可以通过API提交核苷酸序列、基因标识符或自然语言查询。序列查询时，malva将查询序列切分为k-mer，采用滑动窗口策略（默认窗口64 bp）计算每个窗口中匹配k-mer的比例，超过阈值（默认0.65）即判定为阳性匹配。这种方法能够容忍一定程度的测序错误和突变。查询延迟仅取决于磁盘访问：单个k-mer查询约70毫秒，1 kb转录本约0.9秒，1000个转录本约1分钟。自然语言查询则通过集成的大语言模型（Llama 3.1）翻译为结构化搜索。查询结果返回匹配的细胞列表及其元数据（细胞类型、组织、疾病状态等），并支持表达水平、覆盖度谱和空间定位三种视图。此外，malva还预计算了高频基因的伪计数矩阵以加速常见查询。

在无参考分析阶段，malva支持从序列组成直接进行细胞聚类和细胞间相似性分析。平台将序列k-mer折叠为序列相似性桶，构建细胞-特征矩阵，然后进行主成分分析等降维操作。这一过程不依赖任何基因注释，适用于缺乏高质量参考基因组的物种。此外，malva还能对细胞类型特异性的k-mer集合进行从头组装（de novo assembly），生成连续的标记序列，用于发现注释之外的转录特征。

主要结果

研究团队在多个层面验证了malva的性能与生物学价值。

在技术性能方面，malva在肝脏Stereo-seq数据集（约610亿读段）上的索引耗时仅24个CPU小时，比现有方法快4至25倍，峰值内存仅8 GB。通过与参考流程的比较，malva产生的伪计数与标准基因计数在细胞水平和基因水平上均高度相关，且基于伪计数的聚类能有效保留细胞类型和空间组织结构。在细胞系混合物基准测试中，malva的索引速度比flexiplex快4倍，查询在毫秒级完成，且保持了高灵敏度和特异性。对测序错误的模拟显示，在高达2%的错误率下，malva的分析结果保持稳定。

在生物学应用方面，malva展示了多方面的能力。首先，通过搜索病毒基因组和实验载体序列，malva成功检测到了PhiX spike-in、支原体污染以及慢病毒载体等序列，同时阴性对照（如SARS-CoV-2等在索引中不存在的病毒）未产生假阳性信号。其次，malva对296,985个常见种系单核苷酸多态性（SNP）的筛选结果与1000 Genomes Project的群体等位基因频率高度一致，证实了其在单细胞水平上重现群体遗传结构的能力。第三，malva通过覆盖度查询揭示了PTPRC基因在B细胞中的外显子A选择性包含（CD45RA亚型），重现了已知的免疫细胞亚型特异的异构体表达模式；对Add2基因3′非翻译区（UTR）的分析则揭示了其在发育中的神经组织中远端polyA位点的优势使用，与空间转录组数据一致。第四，malva成功探测到了circRNA（如CDR1AS）在兴奋性神经元中的特异性表达。第五，在泛癌体细胞突变检测中，malva对280个肿瘤样本的突变恢复灵敏度约为0.94，特异性接近1，且灵敏度不受突变细胞数量少的影响。

在无参考分析方面，malva对约3000万个健康人类细胞的主成分分析结果显示，基于序列桶的嵌入与基于基因计数的嵌入在邻域保持和聚类相似性上具有可比性，但在某些组织中两者捕获了不同的结构，体现了序列级信息的互补价值。在非模式生物（如丝盘虫Trichoplax和Hoilungia）中，序列基础的聚类与基因注释高度一致。在一个头颈部肿瘤空间转录组样本中，序列基础的聚类除了重现肿瘤和基质区域外，还发现了两个额外的k-mer特异性聚类。对这些聚类的从头组装发现了KLK10基因的截短3′UTR异构体以及来自口腔细菌（如Gemella morbillorum）的23S rRNA序列，这些信息在传统的基因表达矩阵中完全不可见。

结论与意义

malva平台成功地将单细胞图谱从静态的基因计数表转变为动态的、序列解析的资源。其科学价值在于首次实现了在数亿个单细胞中对任意RNA序列的即时搜索，填补了单细胞分辨率与序列级查询之间的空白。应用价值方面，malva为研究人员提供了无需下载和处理PB级原始数据的可能性，极大地降低了序列探索的门槛，尤其适用于癌症突变检测、病原体筛查、异构体分析以及生物多样性研究等场景。此外，malva的API设计使其能够灵活连接至先进的人工智能模型，为人工智能辅助的生物学分析提供了检索层，使模型能够在推理过程中回到原始实验数据中进行验证和细化。研究团队还指出，malva的伪计数是半定量指标，后续仍需针对具体任务进行质量控制和验证，但该平台为生命科学领域提供了一个具有变革潜力的基础工具。