在《Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis》期刊2020年发表的一项研究中，来自中国检验检疫科学研究院和北京中医药大学的陈孟（Meng Chen）、王鹏龙（Penglong Wang）等多位研究者共同完成了一项题为《黄连解毒汤综合研究：揭示其天然沉淀物中的自组装植物化学复合物》的研究工作。该研究隶属于中药物质基础分析领域，特别是针对中药汤剂的复杂体系进行深入表征。
此项研究的学术背景源于对传统中药汤剂现代化理解的迫切需求。黄连解毒汤（HuangLian JieDu Decoction, HLJDD）是一个经典的复方，由黄连、黄芩、黄柏和栀子四味药材组成，临床上广泛应用于抗炎、解毒等。中药汤剂在煎煮过程中常会产生天然沉淀物，临床上常被滤除丢弃。然而，前期研究表明，这些沉淀物可能具有与其上清液相当甚至更强的药理活性。因此，全面解析黄连解毒汤上清液和沉淀物的化学组成，并探究沉淀物的形成机制，对于正确认识该复方的药效物质基础、提高其临床应用价值至关重要。本研究旨在采用先进的分析技术，对黄连解毒汤的两种形态（上清液与天然沉淀物）进行全面化学分析，鉴定其中的化学成分，并特别关注沉淀物中特定成分显著富集的现象，进而深入探究其背后的分子自组装机制。
详细工作流程：
本研究包含几个紧密相连的实验流程，涵盖了从样品制备、全面化学表征到特定复合物深入研究的完整链条。
流程一：样品制备与处理 研究首先严格按照传统配比（黄连：黄芩：黄柏：栀子 = 3:2:2:3）制备了黄连解毒汤。将药材粉末装袋后，加水回流提取30分钟，过滤后静置过夜，使其自然分层，从而分离得到上清液和天然沉淀物两部分。这两部分分别经过浓缩和干燥处理，得到固体样品。同时，为了后续验证，也分别制备了各单味药（黄连、黄芩）的煎液。
流程二：基于超高液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱（UHPLC-Q-Orbitrap HRMS）的全面化学分析 这是本研究的核心定性分析部分。研究者使用Thermo Scientific Ultimate 3000液相色谱系统联用Q Exactive质谱仪对处理后的上清液和沉淀物样品进行分析。他们系统地优化了色谱条件（包括色谱柱、流动相、梯度、温度、流速）和质谱参数（离子源温度、气体流速、分辨率、碰撞能量等），最终确定了使用Acquity BEH C18色谱柱，以含0.1%甲酸的水和乙腈为流动相进行梯度洗脱的最佳方案。质谱数据采集采用全扫描/数据依赖二级扫描（Full-scan MS1/dd-MS2）模式，在正、负离子模式下分别进行，以保证对不同极性化合物的全面覆盖。数据通过Xcalibur和TraceFinder软件处理，并利用Thermo Orbitrap传统中药数据库（OTCML）及自建数据库，结合高精度质量数（质量误差 ppm）和MS/MS碎片信息进行化合物鉴定。此外，研究者还运用Mass Frontier软件对典型化合物的质谱裂解途径进行了深入解析和预测。
流程三：14种标志性成分的定量分析 在定性分析的基础上，研究建立了同时定量测定黄连解毒汤中14种标志性成分的方法。这14种成分包括绿原酸（chlorogenic acid）、黄柏碱（phellodendrine）、栀子苷（geniposide）、灯盏乙素（scutellarin）、黄连碱（coptisine）、药根碱（jatrorrhizine）、巴马汀（palmatine）、小檗碱（berberine）、黄芩苷（baicalin）、木蝴蝶苷（oroxindin）、黄芩素（baicalein）、白杨素（chrysin）、千层纸素A（oroxylin A）和氧化小檗碱（oxyberberine）。该方法经过了系统的方法学验证，包括线性范围、检测限（LOD）、定量限（LOQ）、日内日间精密度和加标回收率等。验证结果表明该方法准确可靠。随后，使用该方法分别测定了上清液和沉淀物中这14种成分的含量。
流程四：黄芩苷/小檗碱自组装复合物的形成验证与表征 定量分析结果显示，沉淀物中黄芩苷和小檗碱的含量显著高于上清液（分别高出21倍和18倍），这强烈暗示两者之间可能发生了相互作用。为了验证这一假设，研究者设计了一系列实验。首先，他们模拟了煎煮过程，将黄芩和小檗的单煎液混合，观察到了水凝胶的形成。接着，他们直接用黄芩苷和小檗碱的标准品溶液在加热和弱碱性条件下混合，也立即形成了水凝胶。将冻干后的水凝胶重新溶解，用于后续一系列表征实验。这些表征手段包括： 1. 电喷雾质谱（ESI-MS）：直接灌注分析，在负离子模式下观察到了黄芩苷与小檗碱以1:1结合形成的去质子化复合物离子峰（[baicalin+berberine-2H]⁻, m/z 780.2），并通过MS/MS碎片分析确认了其结构组成。对黄连解毒汤沉淀物的UHPLC-HRMS分析也检出了该复合物峰，进一步确证其在真实样品中的存在。 2. 毛细管电泳-紫外检测（CE-UV）：分析混合溶液时，除了游离的黄芩苷和小檗碱峰外，出现了一个新的迁移峰，推测为复合物。 3. 核磁共振氢谱（¹H-NMR）：对复合物的NMR谱图进行分析，确认了复合物的形成（文中指出详细数据见补充材料）。 4. 光谱学表征：包括紫外-可见光谱（UV-Vis）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）和荧光光谱（Fluorescence Spectroscopy）。UV-Vis光谱显示复合物的吸收峰兼具黄芩苷和小檗碱的特征。FTIR光谱中，黄芩苷的羰基特征峰（1727.98 cm⁻¹）在与小檗碱形成复合物后移至1612.27 cm⁻¹，表明小檗碱的季铵离子与黄芩苷的羧基之间可能存在静电相互作用，影响了羰基的振动。荧光光谱观察到复合物的发射峰发生蓝移。 5. 形貌与粒径表征：使用扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）观察，发现复合物自组装形成了均匀的球形纳米颗粒。动态光散射（DLS）测得其平均粒径约为174纳米。
主要结果：
结果一：全面化学组成鉴定 通过UHPLC-Q-Orbitrap HRMS分析，成功从黄连解毒汤中共鉴定出109种化学成分。这些成分根据其化学结构类型可分为：32种生物碱（主要来自黄连和黄柏）、39种黄酮类化合物（主要来自黄芩）、12种环烯醚萜类（主要来自栀子）、9种酚酸以及17种其他化合物（如苯丙素、香豆素等）。研究详细解析了代表性生物碱（如木兰碱、小檗碱）、黄酮（如黄芩苷、黄芩素）和环烯醚萜（如山栀子苷、栀子苷）的质谱裂解途径，为同类化合物的鉴定提供了参考。
结果二：标志成分定量分布差异 定量分析结果显示，所检测的14种标志性成分在上清液和沉淀物中均有分布。上清液中含量最高的三种成分是黄芩苷（121.48 μg/g）、栀子苷（74.33 μg/g）和小檗碱（19.00 μg/g）。最关键的发現在于：沉淀物中黄芩苷和小檗碱的含量分别高达2562.21 μg/g和337.37 μg/g，显著富集。这一量化数据为“沉淀物富含活性成分”的假设提供了直接证据，并自然地将研究导向对这两种成分相互作用机制的探索。
结果三：黄芩苷-小檗碱复合物形成的确凿证据 这是本研究最具创新性的发现部分。一系列互补的表征技术从多个维度证实了黄芩苷和小檗碱能够自发形成稳定的复合物： * 质谱与色谱证据：ESI-MS直接检测到1:1复合物离子；UHPLC-HRMS在真实沉淀物样品中亦检出该复合物；CE-UV中出现新峰，均直接证明复合物的存在。 * 相互作用力证据：FTIR光谱中羧基峰的显著位移，强有力地支持了带正电的小檗碱季铵离子与带负电的黄芩苷羧基之间的静电吸引是驱动复合物形成的关键作用力之一。 * 复合物高级结构证据：SEM和TEM图像直观展示了复合物自组装形成了纳米尺度的球形结构，DLS数据则定量给出了其粒径分布。这表明相互作用不仅停留在分子结合层面，还进一步导致了有序的超分子组装。
这些结果环环相扣：全面分析揭示了沉淀物的复杂化学组成；定量差异凸显了黄芩苷和小檗碱的异常富集；而后续的复合物研究则成功揭示了这种富集现象背后的分子机制——即通过静电作用等分子间力驱动的自组装。
结论与意义：
本研究得出明确结论：黄连解毒汤煎煮过程中产生的天然沉淀物并非无效残渣，而是一个富含多种活性成分的复杂体系。其中，来自黄芩的黄芩苷和来自黄连的小檗碱通过分子间作用力（特别是静电相互作用）发生自组装，形成了纳米尺度的复合物，并因此大量富集于沉淀物中。这种自组装行为是沉淀物形成的重要机制之一。
该研究的科学价值重大：首先，它首次综合利用高分辨质谱、光谱学和显微成像等多种先进技术，系统阐明了黄连解毒汤沉淀物的化学本质及其形成机制，为理解其他中药复方汤剂中类似沉淀现象提供了范例和研究思路。其次，研究证实了自组装超分子复合物可以作为中药复方中“化学成分相互作用”的一种具体表现形式，为阐释中药“配伍”理论的现代科学内涵提供了新的视角和实验证据。在应用价值方面，该研究提示，临床使用或工业化生产中随意丢弃中药汤剂的沉淀物可能导致大量活性成分（尤其是通过自组装形成的复合成分）的损失，从而影响药效。因此，重新评估沉淀物的药用价值，并考虑在制剂工艺中予以保留或合理利用，对于保证和提高中药复方的临床疗效具有重要意义。
研究亮点：
其他有价值内容： 研究中对质谱裂解规律的详细解析，以及对UHPLC和质谱条件的系统优化过程，为同行开展类似复杂基质分析提供了宝贵的技术参考。此外，通过混合单味药煎液模拟复方沉淀形成的实验，直观且有力地支持了复方配伍导致新物质形态产生的观点。