本研究由Janna Heide、Agnes J. Bilecz、Samarjit Patnaik等来自美国芝加哥大学、美国国立卫生研究院国家转化科学推进中心（NCATS）、德国马克斯·普朗克生物化学研究所、Schrödinger公司等多个机构的科研人员共同完成。研究论文《NNMT inhibition in cancer-associated fibroblasts restores antitumour immunity》已在线发表于顶级学术期刊《自然》（*Nature*）上。
该研究属于肿瘤微环境与免疫治疗交叉领域。癌症相关成纤维细胞（CAFs）在肿瘤进展和免疫抑制中扮演关键角色，是肿瘤的“帮凶”，但目前尚缺乏有效的CAFs靶向疗法。研究人员先前已发现胞质酶烟酰胺N-甲基转移酶（Nicotinamide N-methyltransferase, NNMT）是促使正常成纤维细胞重编程为CAFs的代谢调节因子。NNMT催化S-腺苷甲硫氨酸（SAM）的甲基转移至烟酰胺（NAM），产生1-甲基烟酰胺（1-MNA）和S-腺苷同型半胱氨酸（SAH）。此反应消耗甲硫氨酸循环中的甲基供体，导致DNA、RNA和组蛋白甲基化水平降低，引发表观遗传改变。多项研究显示，基质中NNMT高表达与多种癌症患者的不良预后相关。然而，NNMT表达的CAFs促进肿瘤进展的具体机制，尤其是其在塑造免疫抑制性肿瘤微环境中的作用，尚不清楚。因此，本研究旨在深入探究NNMT在CAFs中的功能机制，并基于此开发新型靶向抑制剂，以期逆转免疫抑制、恢复抗肿瘤免疫，为联合免疫检查点阻断疗法提供新策略。
本研究流程复杂，环环相扣，主要包含以下核心环节：
第一环节：临床样本分析与NNMT表达特征确认。 研究团队首先利用空间转录组学技术，对包含55个样本（来自30名未经化疗的高级别浆液性卵巢癌患者）的组织芯片（TMA）进行分析。通过免疫荧光染色区分癌细胞（pan-CK+）、免疫细胞（CD45+）和巨噬细胞（CD163+），并通过阴性选择（CD45−pan-CK−CD163−）结合连续H&E切片形态学鉴定CAFs。分析发现，与癌旁卵巢基质相比，卵巢癌基质中有113个转录本上调，包括细胞外基质成分（如COL1A1, COL3A1）和补体因子（C3, C1QC等）以及NNMT。NNMT表达从癌旁基质到卵巢癌基质再到网膜转移灶逐步升高。根据免疫组化染色强度，将癌基质分为NNMT低、中、高表达组。基因集富集分析（GSEA）显示，NNMT高基质中148条上调通路主要与免疫功能相关。免疫反卷积分析进一步揭示，NNMT高基质中效应/记忆CD8+ T细胞丰度更低，这一发现在独立的TMA队列中通过CD8和颗粒酶B（Granzyme B）共染色得到验证。随后，对7名患者化疗前网膜转移灶进行的单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析，鉴定出8个不同的CAFs亚群，并证实NNMT在所有CAFs亚型中均高表达。对已发表的泛癌scRNA-seq数据集分析也确认了NNMT在多种恶性肿瘤（如乳腺癌、结肠癌）的CAFs中普遍高表达。
第二环节：基因敲除小鼠模型验证NNMT的体内功能。 为探究基质NNMT对肿瘤生长的影响，研究使用了全身性NNMT CRISPR敲除（NNMT−/−）的免疫健全小鼠模型。在多个同源肿瘤模型（包括卵巢癌HGS-2和ID8模型、乳腺癌E0771-LMB模型、结肠癌MC38模型）中，NNMT−/−小鼠的肿瘤负荷和转移灶均显著小于野生型（NNMT+/+）对照小鼠。流式细胞术分析显示，NNMT−/−小鼠肿瘤中CD8+ T细胞数量增加，且体外刺激后产生的IFNγ和TNF更多，表明T细胞功能增强。通过抗体清除CD8+ T细胞，可以逆转NNMT−/−小鼠中肿瘤生长受抑的表型，证明其抗肿瘤效应依赖于CD8+ T细胞。 为明确NNMT作用的细胞类型，研究进行了骨髓嵌合体实验。将野生型或NNMT−/−小鼠的骨髓移植给经致死剂量照射的受体鼠。结果发现，当受体鼠为NNMT−/−（即基质缺乏NNMT）时，肿瘤生长受到抑制且CD8+ T细胞活化增强；而供体鼠骨髓细胞是否缺失NNMT则不影响肿瘤生长。这证明NNMT在非免疫细胞（即基质细胞）中驱动肿瘤进展。进一步的回复实验证实，从NNMT−/−小鼠分离的乳腺脂肪垫成纤维细胞，通过恢复NNMT表达后，与肿瘤细胞共注射至NNMT−/−小鼠体内，能够显著促进肿瘤生长，反之则不能。这直接证明了成纤维细胞中的NNMT表达足以驱动肿瘤生长。
第三环节：机制探究——NNMT如何招募免疫抑制性髓系细胞。 为解析NNMT表达的成纤维细胞抑制CD8+ T细胞的机制，研究在NIH-3T3成纤维细胞中过表达NNMT（3T3-NNMT）。RNA-seq分析显示，3T3-NNMT细胞中与髓系细胞迁移、活化和补体激活相关的通路富集。与此一致，在野生型小鼠的ID8和MC38肿瘤中，具有强大CD8+ T细胞抑制功能的Ly6C^high单核细胞和单核来源的Ly6C^int F4/80^+ CD206^+肿瘤相关巨噬细胞显著增多。体外Transwell实验证实，Ly6C^high单核细胞会向3T3-NNMT的条件培养基迁移。全局蛋白质组学分析则发现，3T3-NNMT条件培养基中补体因子显著富集。在体实验也证实野生型MC38肿瘤中C3蛋白水平更高。 补体激活会形成C5转化酶，将C5裂解为C5a和C5b，其中C5a是强效的单核细胞趋化因子。研究使用CRISPR-Cas9敲除3T3-Nnmt细胞中的C3基因，发现可显著减少单核细胞的体外和体内迁移，其效果与使用C5a受体（C5aR）阻断剂相似，而C3a受体抑制则无影响。在肿瘤微环境中，野生型肿瘤的Ly6C^high单核细胞C5aR表达增加，且其表达与PD-L1水平正相关。这些单核细胞在NNMT表达的成纤维细胞条件培养基诱导下，PD-L1表达上调，并获得抑制CD8+ T细胞增殖的能力（即呈现髓源性抑制细胞（MDSC）样表型），而这种抑制能力可被成纤维细胞中C3的敲除所逆转。对人类HGSOC样本的免疫荧光染色也证实，NNMT高基质中单核细胞（CD14+）浸润更多。
第四环节：表观遗传机制解析——NNMT如何驱动CAFs表型。 NNMT通过消耗SAM，降低抑制性组蛋白标记H3K27的三甲基化（H3K27me3）水平，从而驱动基因表达改变。在3T3-Nnmt细胞中，组蛋白甲基化水平降低，同时补体因子和CAFs相关基因表达上调。scRNA-seq数据也显示，CAFs中NNMT表达与补体因子表达呈强正相关。染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）分析进一步证实，NNMT表达导致H3K27me3峰值区域缩小，多个促肿瘤的CAFs标志基因表达增加。此外，恢复NNMT表达能使成纤维细胞体积增大（CAFs的形态特征之一），而补充甲硫氨酸（SAM前体）可以增加SAM水平，部分逆转NNMT驱动的补体因子转录上调。这些证据表明，NNMT通过诱导H3K27me3低甲基化，从表观遗传层面驱动了CAFs样表型和免疫抑制性因子（如补体）的分泌。
第五环节：新型高效NNMT抑制剂（NNMTi）的开发与验证。 由于现有NNMT抑制剂效力有限或生物利用度不佳，本研究通过高通量筛选152,778个小分子化合物（使用检测SAM转化为SAH的生化发光法MTase-Glo），鉴定出一个先导化合物。经过超过350个结构活性导向的类似物设计、合成与测试，最终开发出一种高效、特异的NNMT抑制剂（NNMTi，编号NCGC00685960）。该抑制剂在生化检测中的IC50低于10 nM，在细胞水平抑制1-MNA生成的IC50低于20 nM。其立体异构体中的R构型（NNMTi-d）活性显著降低（IC50 > 2000 nM），可作为分子伪阴性对照。NNMTi具有良好的口服生物利用度（47%），且对735种蛋白激酶、甲基转移酶等酶类的筛选显示其特异性高。 体外实验表明，NNMTi可增加CAFs中H3K27三甲基化水平，降低1-MNA分泌，恢复SAM水平，并削弱CAFs的标志性功能——胶原收缩能力。在多种小鼠肿瘤模型（卵巢癌HGS-2、乳腺癌E0771-LMB、结肠癌MC38）中，腹腔注射、瘤内注射或吸入给与NNMTi均能显著降低肿瘤负荷和转移。重要的是，当与缺乏NNMT的成纤维细胞共注射时，NNMTi无抗肿瘤效果，证明其作用靶点是基质中的NNMT。机制上，NNMTi治疗降低了肿瘤中的C3蛋白水平，减少了免疫抑制性Ly6C^high PD-L1^high单核细胞的浸润，同时增强了肿瘤内CD8+ T细胞的活化和细胞因子产生。
第六环节：NNMTi与免疫检查点阻断（ICB）的联合治疗。 在MC38结肠癌模型中，NNMTi与抗PD-1抗体或抗CD47抗体联合治疗显示出叠加的抗肿瘤效果。在更具侵袭性且对ICB耐药的E0771-LMB乳腺癌模型中，NNMTi联合抗PD-1或抗CD47治疗，其效果显著优于任一单药治疗。这表明靶向CAFs中的NNMT能够逆转由其介导的免疫抑制，从而恢复或增强免疫检查点阻断疗法的疗效。
数据分析和实验方法：本研究综合运用了空间转录组学（GeoMx DSP）、单细胞RNA测序（10x Genomics）、流式细胞术、蛋白质组学、代谢组学（LC-MS检测SAM、1-MNA）、ChIP-seq、高通量药物筛选与化学优化、多种基因工程小鼠模型（全身敲除、骨髓嵌合体）以及人工智能细胞分割算法等前沿技术。数据分析涉及差异表达分析（limma）、基因集富集分析（GSEA）、免疫反卷积（SpatialDecon）、单细胞聚类与注释（Seurat）等多种生物信息学方法。
本研究系统性地揭示了NNMT作为CAFs核心表观遗传调节器，通过“代谢-表观遗传-免疫”轴驱动肿瘤免疫抑制的新机制。具体而言，NNMT→SAM消耗→H3K27me3低甲基化→补体分泌→C5a/C5aR信号→MDSCs募集与活化→CD8+ T细胞抑制，构成了一条清晰的促肿瘤通路。 其科学价值在于：① 深化了对CAFs异质性背后共同调控枢纽的认识，提出NNMT可作为泛CAFs标志物和治疗靶点；② 首次将NNMT的表观遗传调控功能与补体系统激活和MDSCs介导的免疫抑制直接联系起来，为理解肿瘤微环境的免疫逃逸机制提供了全新视角；③ 证明了靶向肿瘤基质代谢/表观遗传重塑是克服肿瘤免疫抑制的有效策略。 其应用价值在于：① 所开发的NNMTi是具有高度转化潜力的候选药物，为临床提供了首个靶向CAFs中NNMT的高效工具；② NNMTi与现有免疫检查点抑制剂的联合方案，为对抗ICB耐药性肿瘤开辟了新的治疗途径，具有重大的临床转化前景。
本研究还提供了丰富的补充数据，包括不同CAFs亚型的详细基因特征、NNMTi的详细化学结构与特性、以及其在多种给药途径下的疗效数据，这些都为后续研究和药物开发提供了宝贵资源。论文中关于利用NNMTi-d作为活性对照的设计，也体现了严谨的科研思路。