孙博宇、寻子煜、周子祥等研究者与北京协和医院多个科室合作，于2025年在《Journal of Translational Medicine》期刊上发表了一项关于免疫检查点抑制剂（Immune Checkpoint Inhibitors， ICIs）诱导的免疫相关性心肌炎（immune-related myocarditis）的原创性研究。这项研究聚焦于肿瘤学与心血管免疫学的交叉领域。随着以PD-1/PD-L1和CTLA-4为靶点的免疫疗法在过去十年深刻变革了癌症治疗模式，其在带来显著生存获益的同时，也伴随着影响多器官的免疫相关不良事件（immune-related adverse events， irAEs）。其中，免疫相关性心肌炎虽属罕见，但其死亡率高达25%至50%，构成了严重的临床威胁。目前，糖皮质激素是一线推荐疗法，但部分患者反应不佳，且该疾病的特异性病理机制尚不完全清楚。先前基于小鼠模型的研究主要集中于浸润的T细胞和巨噬细胞，对人类患者心肌组织中占比更高的基质细胞（如成纤维细胞、内皮细胞）关注不足。因此，本研究旨在通过单细胞层面的分析，阐明免疫相关性心肌炎心脏组织内独特的炎症微环境，识别关键的致病细胞亚群及其相互作用网络，从而为寻找潜在治疗靶点提供新见解。
研究的核心工作流程围绕单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing， scRNA-seq）技术展开，包含样本采集与数据生成、数据处理与细胞注释、多维度功能分析、以及跨物种验证等多个关键步骤。
首先，在样本采集与数据生成阶段，研究纳入了一名因治疗胰腺神经内分泌癌而接受帕博利珠单抗（一种PD-1抑制剂）联合乐伐替尼后发生免疫相关性心肌炎的71岁男性患者。通过右心室间隔的心内膜心肌活检获取了病变组织样本。作为正常对照，研究从人类细胞图谱（Human Cell Atlas）数据库中下载了4例无心血管疾病史捐献者的正常心脏组织（包括右心室和室间隔样本）的scRNA-seq原始数据。对患者活检组织，研究团队使用多组织解离试剂盒进行消化，通过荧光细胞分析仪评估细胞活率，并去除碎片和死细胞，最终利用SeekOne® MM单细胞3’文库制备试剂盒构建文库，在Illumina NovaSeq 6000平台上进行测序。
其次，在数据处理与细胞注释阶段，研究整合了患者（irAE组）和4例正常捐献者（正常组）的scRNA-seq数据，共计15,639个高质量细胞用于后续分析。使用Seurat软件包进行数据标准化、主成分分析降维，并应用Harmony算法进行批次校正以消除个体间技术差异。通过聚类分析，首先将细胞划分为淋巴细胞、髓系细胞、成纤维细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、周细胞和神经元细胞七大主要类型。随后，对淋巴细胞、髓系细胞、成纤维细胞和内皮细胞进行了亚群细分。例如，淋巴细胞被进一步分为CD4+ T细胞、CD8+效应记忆T细胞（CD8+ Tem）、CD8+耗竭T细胞（CD8+ Tex）、CD8+增殖T细胞（CD8+ Tprolif）和自然杀伤（NK）细胞；内皮细胞被细分为动脉内皮细胞、毛细血管内皮细胞、免疫毛细血管内皮细胞、静脉内皮细胞和淋巴管内皮细胞；成纤维细胞被分为GPX3+、BTG2+、CXCL9+和POSTN+四个亚群。
第三，在多维度功能分析阶段，研究采用了多种生物信息学方法深入挖掘细胞功能状态和相互作用。这包括：1）差异表达基因（Differentially Expressed Genes, DEGs）分析和功能富集分析（GO和KEGG），以识别不同组间或细胞亚群间差异激活的生物学通路。2）基因集变异分析（GSVA）和基因集富集分析（GSEA），评估特定功能基因集（如细胞毒性、耗竭、代谢、炎症相关基因集）的活性。3）拟时序分析（使用Monocle3），推断单核/巨噬细胞亚群间的发育轨迹。4）细胞间通讯分析（使用CellChat软件），系统地推断不同细胞类型间通过配体-受体对进行的信号网络，并比较irAE组与正常组通讯强度的差异。5）转录因子活性预测和细胞因子信号活性预测（使用decoupler和Cytosig平台），揭示调控细胞状态的关键分子。
第四，在跨物种验证阶段，为了验证人类研究发现并评估其在免疫检查点抑制剂相关病理中的特异性，研究分析了五套公开的小鼠scRNA-seq数据集，涵盖了免疫检查点抑制剂相关心肌炎、病毒性心肌炎和自身免疫性心肌炎模型及其对照。通过整合分析和小鼠数据内部的比较，研究旨在确认人类中识别的关键特征是否在小鼠模型中保守，并区分免疫相关性心肌炎与其他病因心肌炎的独特炎症特征。
研究的主要结果系统性地揭示了免疫相关性心肌炎心脏微环境中免疫细胞和基质细胞的深刻变化及其相互作用网络。
在细胞组成上，与正常心脏组织相比，irAE组表现出淋巴细胞、髓系细胞和成纤维细胞比例的显著升高，这与心肌炎状态下免疫细胞浸润和组织修复的过程相符。
在淋巴细胞区室，研究发现irAE组中CD8+ Tex细胞和CD8+ Tprolif细胞的比例显著增加。功能分析显示，irAE组的CD8+ Tem细胞呈现出细胞毒性评分降低而耗竭评分升高的趋势，提示在慢性抗原暴露和持续炎症刺激下，CD8+ T细胞从效应记忆状态向耗竭状态转变。代谢分析进一步发现，irAE组的所有淋巴细胞亚群均表现出氧化磷酸化和脂肪酸氧化活性下降，而糖酵解活性上调，这种代谢重编程是高度炎症环境的典型特征，为细胞增殖和细胞因子合成提供快速能量。
在髓系细胞区室，研究鉴定出一个高表达细胞因子（如CCL3, CCL4, CXCL9, CXCL10）和抗原呈递基因（如HLA-DR家族基因）的抗原呈递巨噬细胞亚群，其在irAE组中比例更高。DEGs分析表明，irAE组的髓系细胞整体上高表达与细胞因子、趋化因子、MHC蛋白和干扰素信号相关的基因。功能富集和GSEA分析证实，这些上调的基因显著富集于NF-κB、TNF、IL-17和趋化因子等促炎信号通路，同时氧化磷酸化通路活性被抑制，而缺氧和炎症反应通路被激活。促炎症特征评分（M1和pro-inflammatory score）分析显示，抗原呈递巨噬细胞、CD14+单核细胞和CD16+单核细胞在irAE组中具有更高的促炎特性。
细胞间通讯分析揭示了irAE组免疫细胞间相互作用的显著增强。具体而言，髓系细胞（尤其是抗原呈递巨噬细胞、CD14+和CD16+单核细胞）作为信号发送者，与淋巴细胞（特别是CD8+ T细胞和NK细胞）之间的通讯强度大幅增加。显著上调的配体-受体对包括TNF-TNFRSF1B、CCL3/CCL4-CCR5/CCR1等，这些相互作用促进了免疫细胞的招募、活化和炎症信号的放大。
研究对基质细胞的深入分析取得了突破性发现。在内皮细胞中，静脉内皮细胞特异性高表达非典型趋化因子受体1（Atypical Chemokine Receptor-1, ACKR1）。ACKR1能够结合并转运CXC和CC家族趋化因子，从而促进循环中白细胞向炎症组织的招募。在成纤维细胞中，研究首次在人类免疫相关性心肌炎组织中鉴定出一个几乎仅存在于irAE组的独特亚群——CXCL9+成纤维细胞。该亚群高表达CXCL9、CXCL10等趋化因子以及抗原呈递相关基因，其通路活性分析显示JAK-STAT和TNFα信号通路高度激活，转录因子分析提示其受MHC II类基因表达和干扰素信号相关转录因子（如IRF1, STAT1）的调控，细胞因子信号预测也显示其具有强烈的促炎特征。
更重要的是，细胞通讯网络分析将上述发现串联起来：CXCL9+成纤维细胞和抗原呈递巨噬细胞是CXC和CC趋化因子的主要生产者，而表达ACKR1的静脉内皮细胞是这些趋化因子的关键接收者。在irAE组中，CXCL2/CXCL3/CXCL8/CXCL9-ACKR1等配体-受体对的相互作用显著增强。这表明，由CXCL9+成纤维细胞和抗原呈递巨噬细胞产生的趋化因子，通过静脉内皮细胞上的ACKR1进行转胞吞作用，被转运至血管腔面，从而强力招募循环白细胞至心脏炎症部位，构成了一个放大炎症的轴心机制。
小鼠scRNA-seq数据的分析验证了人类研究的关键发现。在免疫检查点抑制剂相关心肌炎小鼠中，同样观察到CD8+ T细胞耗竭特征的富集，以及髓系细胞促炎表型的增强。尽管小鼠静脉内皮细胞不表达ACKR1（存在物种差异），但研究鉴定出一个与人类CXCL9+成纤维细胞功能类似的小鼠成纤维细胞亚群（高表达Cxcl9, Cxcl10），该亚群在免疫检查点抑制剂相关心肌炎中特异性富集，同样表现出强烈的JAK-STAT和TNFα通路活性，并且是细胞间通讯网络中最活跃的信号发送者之一。这些跨物种的一致性有力地支持了所识别细胞亚群在免疫相关性心肌炎中的关键致病作用，并突出了其与该疾病类型的特异性关联。
本研究的结论是，通过在单细胞水平上解析人类免疫相关性心肌炎的微环境，研究揭示了一个由CXCL9+成纤维细胞和ACKR1+静脉内皮细胞为核心的独特炎症微环境特征。耗竭的CD8+ T细胞和促炎的髓系细胞共同参与，通过增强的趋化因子信号和细胞间通讯，驱动了心脏组织的炎症和损伤。这项研究不仅深化了对免疫相关性心肌炎病理机制的理解，更重要的是，它识别出多个潜在的治疗干预靶点，例如靶向CXCL9+成纤维细胞的炎症信号、阻断ACKR1介导的白细胞招募、或抑制特定的促炎配体-受体相互作用（如TNF-TNFRSF1B, CCL-CCR1/5），为开发针对这种高死亡率并发症的更精准、有效的治疗策略提供了全新的科学依据。
本研究的亮点主要体现在以下几个方面：第一，研究视角新颖，首次在人类患者样本中系统地同时分析了免疫细胞和基质细胞在免疫相关性心肌炎微环境中的作用，弥补了先前研究多局限于小鼠模型和免疫细胞的不足。第二，发现了关键的致病细胞亚群，特别是几乎特异性存在于病变组织中的CXCL9+成纤维细胞，以及表达ACKR1的静脉内皮细胞，并阐释了二者通过趋化因子信号协同放大炎症的新机制。第三，方法学上综合运用了前沿的单细胞转录组学技术和多层次生物信息学分析流程，从细胞图谱、功能状态、发育轨迹到细胞间通讯进行了全面、深入的刻画。第四，通过整合分析人类和小鼠数据，不仅验证了主要发现，还成功区分了免疫相关性心肌炎相较于病毒性或自身免疫性心肌炎的特异性炎症特征，增强了结论的可靠性和病理特异性。这些发现对于指导未来的基础研究和临床转化具有重要价值。当然，研究也指出了其局限性，如样本量受限于心内膜心肌活检的临床可行性，未能有效捕获心肌细胞，以及缺乏空间转录组等多组学整合等，为后续研究指明了方向。