双数字化免疫分析平台DDA：实现zeptomolar级单分子检测的革命性突破

作者与发表信息
本研究由Zheng Li（南方科技大学/香港理工大学）、Fenggang Li（南方科技大学/北京理工大学）等共同完成，通讯作者为Shuailong Zhang（北京理工大学）、Zuankai Wang（香港理工大学）和Xingyu Jiang（南方科技大学）。成果于2025年11月13日发表于《Journal of the American Chemical Society》（JACS 2025, 147, 43870−43883），标题为《Unlocking Zeptomolar Single-Molecule Detection by Synergizing Digital Microfluidics and Digital CRISPR》。

学术背景
免疫检测是癌症、心血管疾病和传染病诊断的“金标准”，但传统方法（如化学发光法）的灵敏度局限在纳克/毫升至皮克/毫升范围，难以检测超低浓度生物标志物（如心力衰竭标志物NT-proBNP或炎症因子IL-6）。现有技术如数字ELISA（digital ELISA）虽通过微反应室分区实现单分子计数，但仍受限于酶信号弱、背景噪声高和操作复杂等问题。为此，研究团队提出“双数字化”策略：结合数字微流控（digital microfluidics, DMF）的自动化样本处理与CRISPR/Cas13a信号放大系统，开发了全自动平台DDA（dual-digital immunoassay），旨在突破现有检测极限至zeptomolar（10^-21 M）级别。

研究流程与方法

1. 单分子检测系统构建

   • 免疫捕获与信号放大设计：采用2微米磁珠（magnetic beads, MBs）偶联捕获抗体，形成“三明治”免疫复合物。检测抗体标记双链DNA（dsDNA）条形码，触发级联反应：
     
     • RPA-T7-CRISPR/Cas13a：DNA通过重组酶聚合酶扩增（RPA）等温扩增5分钟，T7 RNA聚合酶转录生成单链RNA（ssRNA），激活Cas13a切割荧光RNA报告分子，产生高强度信号（图2a）。
       
   • 优化验证：通过5次洗涤降低背景噪声，验证系统对NT-proBNP（检测限0.1 amol/L）、IL-6（1.5 amol/L）和TNF-α（2.5 amol/L）的特异性（图2d-g）。

2. 微流控芯片开发

   • 芯片结构：由顶部ITO电极板与底部亲水-疏水微井阵列（100万孔，直径3.5 μm）组成，通过电润湿（EWOD）控制液滴运动（图3a-c）。
     
   • 磁珠加载：重力与磁场协同作用实现单磁珠/微井定位，加载效率>90%（图3g）。氟化油（FC-40）密封微井，形成独立反应单元。

3. 全自动化检测流程

   • DDA工作流（图4a）：
     
     1. 样本与捕获抗体磁珠混合；
        
     2. 多步洗涤去除未结合物；
        
     3. 加入DNA标记检测抗体；
        
     4. 加载RPA-CRISPR试剂；
        
     5. 微井阵列数字化分区；
        
     6. 荧光成像与阳性微井计数（图5e）。
        
   • 灵敏度优化：通过8次循环加载100 μL样本，将检测限推至zeptomolar级（图S9）。

主要结果

1. 信号放大效能

   • CRISPR vs 传统酶法：DDA的荧光信号强度比β-半乳糖苷酶（β-gal）系统高40倍，信噪比（SNR）显著提升（图5a-d）。
     
   • 检测限：NT-proBNP低至1 amol/L（≈60个分子/100 μL），较商业超敏检测技术提高>100倍（图5f-h）。

2. 临床验证

   • NT-proBNP与IL-6检测：30例临床血清样本中，DDA检出ELISA漏检的低浓度样本（如1.68 pg/mL NT-proBNP），并与SIMOA检测IL-6结果高度一致（r=0.998）（图6b-e）。
     
   • 多标志物关联分析：平台可同步量化心脏应激（NT-proBNP）与炎症（IL-6）标志物，揭示其协同变化模式（图6f）。

结论与价值
DDA通过整合DMF的自动化优势与CRISPR的级联放大能力，首次实现zeptomolar级蛋白检测，为极低丰度生物标志物（如早期癌症或神经退行性疾病标志物）提供了“样本进-结果出”的一体化解决方案。其模块化设计支持多靶标适配，在心血管风险分层、传染病监测等领域具重大应用潜力。

研究亮点
1. 双数字化创新：DMF（第一级数字化）与CRISPR信号转化（第二级数字化）协同，突破单分子检测极限。
2. 全自动化：磁珠富集、多步洗涤、信号扩增均在芯片完成，避免人工误差。
3. 临床实用性：直接检测复杂血清样本，5分钟内完成RPA扩增，总流程小时。
4. 超低背景：通过优化抗体-DNA偶联比与洗涤程序，背景阳性率<0.01%（图S1）。

其他价值
平台可扩展至核酸检测（如病原体诊断），其开源设计（支持信息中提供序列与芯片参数）促进技术迭代。作者团队开发的AI辅助微液滴蒸发控制算法（参考文献33）进一步提升了反应稳定性。