本研究由重庆医科大学检验医学院、检验医学诊断教育部重点实验室的王冬青、倪忆庐、周钦等研究人员，联合中国科学院高能物理研究所、中国科学院大学的胡毅团队以及内蒙古医科大学基础医学院的陈军团队共同完成。研究成果于2021年9月29日在线发表于生物材料领域权威期刊 Biomaterials 第278卷，论文编号为121161。该研究得到了国家自然科学基金（编号82030065、11875269）、重庆市自然科学基金等多个项目的资助。
手术切除目前仍是大多数实体肿瘤的一线治疗方案，但术后残留的肿瘤细胞可能逃避免疫监视，导致局部复发或远处转移。肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）中存在大量巨噬细胞，约占实体肿瘤质量的50%。然而在免疫抑制性肿瘤微环境中，巨噬细胞易被极化为抗炎型M2表型，即肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages, TAMs），其主要表现为促肿瘤效应，不仅无法杀伤肿瘤细胞，还会通过分泌细胞因子或酶来抑制T细胞的募集和活化。因此，将M2型TAMs“再教育”为促炎型M1巨噬细胞已成为改善抗肿瘤免疫治疗效果的关键策略之一。
尽管已有多种化学化合物、生物大分子和纳米材料被用于M2巨噬细胞的再教育，但这些策略普遍存在生物相容性欠佳、表面配体不足或生物功能单一等局限。近年来，细胞膜作为天然来源的生物材料被用于功能化纳米颗粒。巨噬细胞膜富含与极化过程相关的多种细胞表面蛋白，并能够识别炎症区域，因而已被开发为免疫治疗疫苗。此外，巨噬细胞能特异性结合肿瘤细胞，这使得通过细胞融合技术将巨噬细胞膜与肿瘤抗原整合构建杂交细胞膜成为可能。本研究旨在探究基于巨噬细胞膜的免疫疫苗能否重塑肿瘤微环境并预防术后肿瘤复发。
研究首先从BALB/c雌性小鼠的股骨和胫骨中提取骨髓细胞，并在含有粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF, 20 ng/ml）和脂多糖（LPS, 20 ng/ml）的培养基中培养一周，获得骨髓来源的M1型巨噬细胞（BMDMs）。M1表型通过流式细胞术检测CD11b和CD86的表达加以验证。同时，通过使用白细胞介素-4（IL-4, 20 ng/ml）替代LPS，诱导获得M2型巨噬细胞以作对照。随后，研究采用基于聚乙二醇（PEG）的融合方案，将灭活的4T1小鼠乳腺癌细胞与M1型BMDMs以1:3的比例混合，在预热的50% PEG和二甲基亚砜（DMSO）溶液作用下进行细胞融合。融合细胞在含LPS的培养基中继续培养6天。
融合效果通过多种手段验证。荧光成像显示4T1细胞和M1巨噬细胞成功融合为同时具备亲代细胞膜/胞质并保留各自细胞核的杂交细胞。流式细胞术统计显示94.23%的细胞为双阳性（同时表达GFP和CD86）。蛋白质印迹（Western blot）检测证实融合细胞中表达M1巨噬细胞的重要标志物——诱导型一氧化氮合酶（iNOS）。随后，通过低渗裂解、超声破碎和多步离心的方法，从融合细胞中提取融合细胞膜（fused cytomembrane, FM），经冻干后于-80°C保存备用。平均每1.5×10⁸个融合细胞可制备约5 mg FM。
在FM的基础上，研究进一步将免疫佐剂胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤寡脱氧核苷酸（CpG ODNs）封装入FM，形成FM+。随后将100 μg CpG-ODNs与5 mg FM在1 ml海藻酸钠水溶液（10 mg/ml）中均质混合，逐滴加入含20 mM氯化钙的PBS中形成水凝胶微球，得到FM+@N疫苗。采用扫描电镜观察冻干样品形貌，并通过称重法测定溶胀动力学。CpG ODNs的释放曲线通过检测上清液中CpG ODNs的含量获得。结果表明，FM+@N呈现叶片状微观形貌，细胞膜均匀附着于支架材料上；与仅负载CpG ODNs的水凝胶（+@N）相比，FM+@N中的CpG ODNs释放更为缓慢，约12小时达到平台，且约30%的CpG ODNs被保留在凝胶内部。
研究通过一系列体外实验评估了FM及其衍生物的功能。首先，通过共聚焦显微镜观察不同细胞膜（4T1细胞膜CM、M1巨噬细胞膜M1M和FM）对4T1细胞的靶向性。结果显示CM和FM均表现出对4T1细胞的同源靶向作用，而M1M则主要导致肿瘤细胞死亡。CCK-8实验和活/死细胞染色进一步证实FM对4T1细胞具有选择性杀伤作用，而对不同极化的巨噬细胞（M0、M1、M2）均无明显毒性。其次，通过流式细胞术检测CD86和CD206的表达，发现FM和M1M均能维持M1表型并促使M2巨噬细胞向M1型再转化，而FM+因含有CpG ODNs，其再教育能力更强。Western blot检测显示FM+处理后M2巨噬细胞中iNOS表达升高。ELISA检测发现FM+能显著上调M2巨噬细胞分泌IL-6和TNF-α等促炎细胞因子。此外，通过Transwell共培养体系模拟巨噬细胞与肿瘤细胞共存的微环境，证实经FM+处理的M2巨噬细胞对4T1细胞增殖的抑制效果最为显著。最后，研究还发现FM能够促进骨髓来源树突状细胞（BMDCs）的成熟（CD11c+MHC II+CD86+）和抗原交叉呈递（CD11c+MHC I+），且FM+的促进效果优于单独的CM或M1M。
体内研究采用免疫健全的BALB/c小鼠模型。主瘤模型为：将1×10⁶个4T1细胞或4T1-luc细胞皮下注射至小鼠右侧胁部。当肿瘤体积达到约300 mm³时，手术切除约90%的肿瘤以模拟不完全切除，随后将不同组别的水凝胶微球（空白水凝胶N、CM@N、M1M@N、FM@N、FM+@N，含1 mg相应膜成分）植入术后创腔，另设对照组（CTR）不进行植入。每组6只小鼠。术后每两日记录肿瘤体积和小鼠体重，第21天处死小鼠，收集肿瘤和主要器官进行组织学分析（H&E、Ki67、TUNEL和CD86染色）以及流式细胞术检测浸润T细胞（CD3+CD4+、CD3+CD8+）、M1/M2巨噬细胞比值（CD45+CD11b+F4/80+CD86+/CD206+）和树突状细胞成熟与交叉呈递。远处肿瘤模型为：主瘤切除后，在小鼠左侧胁部接种2×10⁵个4T1细胞作为远处肿瘤，观察疫苗对远处肿瘤生长的抑制效果，并在第21天分析远处肿瘤中的免疫细胞浸润、脾脏中的记忆T细胞（CD3+CD8+CD44+CD62L⁻）以及肺转移情况。
共聚焦成像显示，Dio预标记的CM和FM能够被4T1细胞有效内化，而M1M不被4T1细胞摄取。活/死染色和Annexin V/PI凋亡检测证实CM仅具有靶向性但杀伤力弱，M1M则具有较强杀伤力但缺乏靶向性，而FM同时兼具同源靶向和肿瘤杀伤能力。CCK-8实验表明FM对多种极化的巨噬细胞（包括Raw264.7和BMDMs来源的M0、M1、M2）均无明显毒性，说明FM具有良好的生物相容性。
流式细胞术定量分析显示，FM和M1M均能提高Raw264.7和BMDMs来源M2巨噬细胞中CD86的表达，降低CD206的表达，其中FM+的再教育能力最强。Western blot证实FM+处理后M2巨噬细胞中iNOS蛋白水平升高。ELISA结果显示FM+可显著上调M2巨噬细胞分泌IL-6和TNF-α。在Transwell共培养实验中，经FM+处理的M1和M2巨噬细胞均表现出增强的抗4T1细胞增殖能力，且FM+组效果最佳。此外，FM+处理后的BMDCs成熟率和MHC I交叉呈递水平均显著高于CM或M1M处理组，表明FM+具有更强的免疫刺激功能。
海藻酸钠水凝胶在10 mg/ml浓度下表现出适中的溶胀行为和结构完整性，在含Ca²⁺的溶液中溶胀8小时达到平衡，24小时内保持完整。体内降解实验显示空白水凝胶和FM+@N疫苗在皮下植入后3-4天内完全降解。CCK-8实验证实水凝胶包载FM+后仍能有效杀伤4T1细胞，同时对各种巨噬细胞无显著毒性。
在小鼠原位肿瘤复发模型中，CTR组和空白水凝胶N组均出现明显肿瘤复发，而FM+@N组在第21天时肿瘤体积和生物发光信号均最低，肿瘤重量也最轻。H&E、Ki67和TUNEL染色显示FM+@N疫苗引起了显著的肿瘤细胞死亡。流式细胞术分析显示，FM+@N疫苗处理组肿瘤内M1/M2巨噬细胞比值最高，树突状细胞成熟和交叉呈递水平显著增强，CD8+ T细胞浸润比例也明显增加。此外，血清中IL-6和TNF-α水平在FM+@N组中最高。值得注意的是，M1M@N组虽然在促进树突状细胞成熟和CD8+ T细胞活化方面效果较弱，但在抑制肿瘤复发方面同样表现出较强效果，这提示巨噬细胞再极化在抗肿瘤免疫中发挥关键作用。
在远处肿瘤模型中，FM+@N疫苗不仅抑制了原发灶的肿瘤复发，还显著抑制了对侧远处肿瘤的生长。免疫荧光染色显示FM+@N组远处肿瘤中CD86阳性（M1型）巨噬细胞增多，CD206阳性（M2型）巨噬细胞减少。引流淋巴结中树突状细胞成熟和交叉呈递水平在FM+@N组中最高。脾脏中记忆T细胞（TEM细胞，CD3+CD8+CD44+CD62L⁻）比例在FM+@N组显著增加，远处肿瘤中CD8+ T细胞浸润也明显增多。此外，肺转移结节数量在FM+@N组显著减少，H&E染色进一步证实肺转移受到抑制。
整个实验过程中，各组小鼠体重未出现显著变化。主要器官（心、肝、脾、肺、肾）的H&E染色显示FM+@N疫苗未引起明显的组织损伤。此外，疫苗植入并未影响术后创口的正常愈合，表明FM+@N疫苗具有良好的体内生物相容性和安全性。
本研究成功构建了一种由M1巨噬细胞与肿瘤细胞融合膜、CpG ODNs和藻酸钙水凝胶组成的可植入疫苗FM+@N。该疫苗能够通过再教育M2型TAMs向M1型转化，重塑免疫抑制性肿瘤微环境；同时通过提供肿瘤抗原和免疫佐剂，促进树突状细胞成熟与抗原交叉呈递，进而激活CD4+和CD8+ T细胞免疫应答，形成肿瘤微环境中的自补给免疫循环。动物实验证实，FM+@N疫苗能够在原发灶和远处灶同时抑制肿瘤复发，并减少肺转移。该研究的科学价值在于揭示了基于融合细胞膜的多功能疫苗平台在免疫治疗中的潜力，为术后肿瘤免疫治疗提供了新的策略；其应用价值在于该疫苗完全由生物大分子和天然来源材料制备，具有良好的生物相容性和安全性，有望转化为临床可用的术后辅助免疫治疗手段。
本研究的亮点主要体现在以下几个方面：第一，通过细胞融合技术将M1巨噬细胞膜与肿瘤细胞膜整合为杂交膜，实现了同源靶向、肿瘤杀伤和免疫调控等多种功能的统一；第二，利用CpG ODNs增强杂交膜的免疫刺激活性，通过协同作用显著提升了巨噬细胞再教育和树突状细胞活化的效率；第三，采用藻酸钙水凝胶作为局部递送载体，实现了疫苗在肿瘤部位的时空控制释放，减少了全身副作用；第四，该疫苗完全避免了合成纳米颗粒的使用，从而规避了化学毒性和长期滞留等潜在问题，具有优越的生物安全性；第五，研究发现M1M@N在抑制肿瘤复发方面同样表现出较强的效果，提示巨噬细胞再极化本身即可作为独立的抗肿瘤策略，这一发现丰富了对肿瘤免疫治疗机制的理解。
论文还指出，FM+@N疫苗在远处模型中对树突状细胞交叉呈递和记忆T细胞的促进作用与FM@N组无显著差异，这可能是由于检测时间点较早，CpG ODNs的效应尚未完全显现；同时，记忆T细胞可能已大量转化为效应T细胞，因此脾脏中记忆T细胞的绝对比例未能反映其真实动态变化。此外，该研究的所有动物实验均经重庆医科大学实验动物管理与使用委员会批准，符合伦理规范。