本研究发表于《Cancer Science》期刊2021年第112卷，是一项针对胰腺癌免疫治疗组合策略的原创性研究。论文第一作者为复旦大学附属中山医院普外科、复旦大学附属中山医院癌症中心的陈强达，共同第一作者为尹瀚林和浦宁。通讯作者为同机构的吴文川和楼文晖。

学术背景 本研究属于肿瘤免疫治疗领域，聚焦于胰腺癌这一高度恶性且难治的肿瘤。尽管以程序性死亡配体-1阻断（Programmed Death-Ligand 1 blockade, PD-L1阻断）为代表的免疫检查点阻断（Immune Checkpoint Blockade, ICB）疗法已在多种癌症中取得成功，但其对胰腺癌疗效甚微，主要归因于胰腺癌肿瘤微环境中效应性免疫细胞浸润不足。趋化因子C-C基序配体21（Chemokine C-C Motif Ligand 21, CCL21）是一种能够通过招募并共定位树突状细胞（Dendritic Cells, DCs）和T细胞来促进T细胞免疫的趋化因子，在多种癌症中显示出抗肿瘤潜力，并被美国国家癌症研究所列为最具潜力的20种癌症治疗药物之一。然而，CCL21在胰腺癌中的作用，特别是其与PD-L1阻断联合应用的抗肿瘤反应和机制，尚不明确。因此，本研究旨在探究CCL21在胰腺癌肿瘤微环境中的功能，阐明其如何影响PD-L1表达，并评估CCL21与PD-L1阻断联合治疗的协同抗肿瘤效果，以期为胰腺癌提供新的有效治疗策略。

详细研究流程 本研究流程复杂且系统，整合了生物信息学分析、体外细胞实验和体内动物实验，主要可分为五个核心步骤。

步骤一：CCL21在胰腺癌中的生物信息学分析及功能预测。 研究团队首先从公共数据库获取数据。他们从癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas, TCGA）和国际癌症基因组联盟（International Cancer Genome Consortium, ICGC）的PACA-AU数据集中，分别获取了168例和269例胰腺癌样本的转录组表达谱和临床信息。利用这些数据，他们进行了多层次分析。首先，使用GeneMANIA在线平台构建CCL21的蛋白质相互作用网络并进行功能富集分析，预测CCL21相关的生物学过程。其次，使用基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis, GSEA）比较TCGA队列中高、低表达CCL21的样本，以识别与CCL21高表达显著相关的基因信号通路。最后，为了探究CCL21与肿瘤免疫微环境的关系，他们采用CIBERSORT算法（一种基于基因表达数据反卷积计算22种免疫细胞亚群比例的工具）分析了TCGA和ICGC队列中肿瘤样本的免疫细胞浸润情况。样本经过筛选，仅保留CIBERSORT算法P值小于0.05的样本（TCGA: 128例；ICGC: 178例），以确保分析结果的可靠性。他们将样本按CCL21表达中位数分为高、低两组，比较了两组间免疫细胞浸润的差异，并分析了CCL21表达与特定免疫细胞比例的相关性。此外，还利用Kaplan-Meier生存曲线分析了CCL21表达水平与患者总生存期（Overall Survival, OS）的关联。

步骤二：在体内验证CCL21对肿瘤生长、T细胞浸润及PD-L1表达的影响。 此步骤旨在在动物模型中验证生物信息学的发现。研究使用小鼠胰腺癌细胞系Panc02构建了稳定过表达CCL21的细胞株（CCL21-OE），并通过定量实时聚合酶链反应（quantitative real-time PCR, qRT-PCR）、蛋白质印迹法（Western Blot）和酶联免疫吸附测定（ELISA）验证了过表达效率。随后，他们将CCL21-OE细胞和对照载体细胞分别皮下接种到免疫健全的C57BL/6小鼠背部，建立同种异体移植瘤模型。肿瘤形成后，定期测量肿瘤体积和重量。最后，处死小鼠获取肿瘤组织，进行免疫组织化学（Immunohistochemistry, IHC）染色，检测肿瘤组织中CCL21、PD-L1、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞的表达和分布，并通过TUNEL（末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记）免疫荧光检测细胞凋亡情况。

步骤三：在体外探究CCL21对胰腺癌细胞PD-L1表达的影响及机制。 此部分使用两种人源胰腺癌细胞系MIA-Paca-2和SW1990进行。首先，研究团队用不同浓度（0-100 ng/mL）和不同时间（0-48小时）的重组CCL21蛋白刺激细胞，通过蛋白质印迹法检测PD-L1蛋白水平的变化，并通过流式细胞术（Flow Cytometry）检测细胞表面PD-L1的表达。同时，通过qRT-PCR检测CCL21刺激后PD-L1 mRNA水平的变化，以判断调控层次。为了探究CCL21上调PD-L1的具体分子机制，他们进行了以下实验：1. 在蛋白质合成抑制剂放线菌酮（Cycloheximide）存在下，检测CCL21对PD-L1蛋白半衰期的影响，评估其对PD-L1稳定性的作用。2. 通过蛋白质印迹法检测CCL21刺激后，Akt信号通路及其下游分子糖原合成酶激酶-3β（Glycogen Synthase Kinase-3β, GSK-3β）的磷酸化水平（激活状态）变化。3. 使用Akt特异性抑制剂LY294002或CCL21的受体CCR7的阻断抗体预处理细胞，再给予CCL21刺激，观察这些干预是否能够逆转CCL21对GSK-3β磷酸化和PD-L1表达的上调作用。4. 通过免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation）实验验证在胰腺癌细胞中PD-L1与GSK-3β是否存在内源性相互作用。

步骤四：评估CCL21诱导的PD-L1上调对T细胞杀伤功能的影响及PD-L1阻断的挽救作用。 研究设计了两套体外T细胞介导的肿瘤细胞杀伤实验。第一套是传统共培养实验：从健康供体外周血单核细胞（PBMCs）中诱导产生抗原负载的DC，并进一步激活产生肿瘤特异性T细胞。将胰腺癌细胞预先用CCL21或PBS处理48小时，然后与激活的T细胞按一定比例共培养4天。在共培养体系中，加入抗人PD-L1阻断抗体或同型对照抗体。最后，清洗掉死亡细胞，对存活的肿瘤细胞进行结晶紫染色，评估T细胞的杀伤效率。第二套是改良的Transwell系统实验，以更好地模拟CCL21的趋化作用：将胰腺癌细胞接种于下室，将肿瘤特异性T细胞置于上室，中间由带孔的膜隔开。下室的肿瘤细胞同样用CCL21预处理，并加入PD-L1阻断抗体。通过比较不同处理组肿瘤细胞的存活情况，评估CCL21的趋化效应及其与PD-L1阻断的协同作用。

步骤五：在体内评估CCL21与PD-L1阻断联合治疗的协同抗肿瘤效果。 在已建立的CCL21-OE Panc02小鼠移植瘤模型基础上，将荷瘤小鼠随机分组。在肿瘤可触及后，分别给予小鼠腹腔注射PD-L1阻断抗体或同型对照IgG抗体，每72小时一次。持续监测并记录各组肿瘤的生长体积和最终重量。实验结束后，取肿瘤组织进行免疫组织化学染色，分析CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、颗粒酶B（Granzyme B，一种细胞毒性标志物）的浸润情况，以及TUNEL阳性凋亡细胞的数量，以评估联合治疗对肿瘤免疫微环境和细胞毒性的影响。

主要研究结果 结果一： 生物信息学分析显示，CCL21在胰腺癌中主要富集于白细胞趋化、炎症反应以及PI3K-Akt信号通路正调控等生物学过程。CIBERSORT算法分析证实，在TCGA和ICGC两个独立队列中，CCL21的高表达均与肿瘤内CD8+ T细胞浸润比例呈显著正相关。然而，生存分析表明，无论是在TCGA队列还是ICGC队列中，仅凭CCL21表达水平的高低并不能显著区分患者的总体生存期。这提示CCL21可能促进了局部免疫反应，但并未转化为明显的生存获益，暗示可能存在其他抵消其益处的机制。

结果二： 体内动物实验验证了上述预测。与对照组相比，过表达CCL21的肿瘤生长速度显著减慢，体积和重量均减小。免疫组化显示，CCL21-OE肿瘤中CD4+和CD8+ T细胞的浸润数量显著增加，凋亡细胞也更多。然而，一个关键的发现是，CCL21-OE肿瘤中的PD-L1蛋白表达水平也同步显著升高。这为解释生物信息学中“CCL21高表达未带来生存优势”提供了线索：CCL21在招募T细胞的同时，可能通过上调PD-L1诱导了免疫逃逸，从而部分削弱了其抗肿瘤效果。

结果三： 体外细胞实验深入阐明了CCL21上调PD-L1的机制。研究发现，CCL21能以时间和剂量依赖的方式，显著增加人胰腺癌细胞中PD-L1的蛋白水平，但对PD-L1的mRNA水平没有影响，表明调控发生在翻译后水平。在放线菌酮存在下，CCL21处理延长了PD-L1蛋白的半衰期，证实CCL21通过稳定PD-L1蛋白来增加其表达。机制探究发现，CCL21能迅速诱导Akt在Ser473位点和其下游靶点GSK-3β在Ser9位点的磷酸化（即激活Akt并抑制GSK-3β活性）。使用Akt抑制剂LY294002或CCR7阻断抗体，可以完全消除CCL21对GSK-3β磷酸化和PD-L1上调的效应。免疫共沉淀实验证实了PD-L1与GSK-3β在胰腺癌细胞中存在直接的相互作用。综合这些结果，研究得出结论：CCL21通过与其受体CCR7结合，激活Akt信号通路，进而磷酸化并抑制GSK-3β的活性。由于GSK-3β通常通过磷酸化PD-L1并促使其被泛素-蛋白酶体系统降解，因此，当GSK-3β被抑制时，PD-L1的降解减少，稳定性增强，最终导致肿瘤细胞表面PD-L1蛋白水平升高。

结果四： T细胞杀伤实验证实了上述机制的生物学后果。当肿瘤细胞被CCL21预处理后，其对抗原特异性T细胞杀伤的抵抗力增强，存活率更高。然而，如果在共培养体系中加入PD-L1阻断抗体，则可以几乎完全逆转CCL21带来的这种“保护”作用，显著恢复T细胞的杀伤效能。在模拟趋化作用的Transwell实验中，CCL21与PD-L1阻断的组合展现了更强的协同杀伤效果。这表明CCL21诱导的PD-L1上调确实是一种免疫逃逸机制，而PD-L1阻断可以有效地克服它。

结果五： 体内联合治疗实验取得了令人鼓舞的结果。与单独过表达CCL21或单独使用PD-L1阻断抗体相比，CCL21过表达联合PD-L1阻断治疗显示出最强的肿瘤生长抑制效果，肿瘤体积和重量最小。免疫组化分析显示，联合治疗组肿瘤中颗粒酶B阳性细胞和凋亡细胞的数量显著高于任何单药治疗组，表明细胞毒性免疫反应被最大程度激活。有趣的是，联合治疗组的T细胞（CD4+和CD8+）浸润数量与单独CCL21过表达组相当，但抗肿瘤效应更强，这突出了在CCL21创造的“免疫细胞富集”环境中，解除PD-L1介导的抑制信号的至关重要性。

研究结论与意义 本研究系统性地揭示了趋化因子CCL21在胰腺癌肿瘤微环境中的双重作用及其分子机制，并提出了一个极具前景的治疗新策略。主要结论如下：1. CCL21能够有效招募T细胞浸润至胰腺肿瘤，并发挥抗肿瘤作用。2. 与此同时，CCL21通过激活Akt-GSK-3β信号轴，在翻译后水平稳定并上调肿瘤细胞上的PD-L1表达，这一作用部分削弱了其自身引发的抗肿瘤T细胞免疫，导致了“边招兵买马，边竖立屏障”的矛盾局面。3. 正是由于CCL21同时提高了PD-L1表达和T细胞浸润——这两者分别是PD-1/PD-L1阻断疗法疗效的潜在预测标志物，因此，将CCL21与PD-L1阻断联合应用可以产生强大的协同效应。在临床前模型中，该组合疗法展现出优于任一单药治疗的肿瘤抑制效果。

本研究的科学价值在于：首次在胰腺癌中详细阐明了CCL21调控PD-L1表达的精确分子通路（CCL21-CCR7-Akt-GSK-3β-PD-L1稳定性），为理解趋化因子与免疫检查点之间的交叉对话提供了新的机制见解。其应用价值更为突出：为解决胰腺癌对免疫检查点抑制剂单药治疗耐药这一临床难题提供了一个有理有据的联合治疗方案。研究提示，通过局部给予CCL21（例如，通过基因修饰的树突状细胞或聚合物递送系统）来“加热”肿瘤微环境、增加T细胞浸润，同时联合全身性或局部PD-L1阻断来解除随之增强的免疫抑制信号，可能是一种高效且有希望的胰腺癌治疗新途径。

研究亮点 1. 研究逻辑严谨、体系完整： 研究遵循了“生物信息学预测→体内表型验证→体外机制深挖→体外功能验证→体内疗效评估”的经典且系统的研究范式，从现象到机制，再到应用，层层递进，证据链坚实。 2. 机制发现新颖且深入： 发现了CCL21通过Akt-GSK-3β轴在翻译后水平调控PD-L1蛋白稳定性的新机制，连接了趋化信号与免疫检查点蛋白调控这两个重要领域。 3. 转化医学意义明确： 研究不仅停留在机制探讨，更通过体内外实验明确验证了“CCL21 + PD-L1阻断”这一组合策略的协同抗肿瘤效果，为后续的临床转化研究提供了直接且有力的临床前数据支持。 4. 数据分析审慎： 在生物信息学分析中，使用了两个独立的公共队列（TCGA和ICGC）进行相互验证，并严格筛选CIBERSORT分析结果，提高了结论的可靠性。

其他有价值内容 论文在讨论部分也指出了本研究的局限性：例如，研究中采用在肿瘤细胞中过表达CCL21来模拟其治疗作用，这与未来临床可能采用的局部给药方式（如瘤内注射CCL21基因修饰的DC或缓释制剂）在技术上有所不同。此外，研究主要关注了PD-L1的变化，CCL21治疗是否会影响其他共抑制或共刺激分子，有待未来进一步探索。这些坦诚的讨论为后续研究指明了方向。该研究得到了中国博士后科学基金、上海市“科技创新行动计划”、国家重点研发计划及上海市申康医院发展中心等多个项目的资助。