一、 研究团队与发表信息
本研究由西南大学化学化工学院、发光分析与分子传感教育部重点实验室的杨国民、张园园、赵金文、何颖、袁若和陈仕洪*等研究人员合作完成。该研究成果以论文形式发表于爱思唯尔旗下的学术期刊 Biosensors and Bioelectronics 第216卷（2022年），论文标题为“Dual-emitting iridium nanorods combining dual-regulating coreaction accelerator Ag nanoparticles for electrochemiluminescence ratio determination of amyloid-β oligomers”。论文于2022年8月12日在线发表。
二、 学术背景与研究目的
本研究属于生物传感与电化学发光分析领域，具体聚焦于构建一种高灵敏度、高选择性的生物传感器，用于阿尔茨海默病早期诊断的关键生物标志物——β-淀粉样蛋白寡聚体的检测。
电化学发光技术结合了化学发光与电化学的优势，具有背景信号低、灵敏度高、易于控制、无光漂白等优点，在生物分析中展现出巨大潜力。传统的电化学发光检测多依赖于单一信号输出，容易受到电极状态、环境干扰等非目标因素的影响，可能导致假阳性或假阴性结果。比率型检测策略通过使用两个信号强度的比值作为输出，可以有效地抵消这些共性的背景干扰，提高检测的准确性和可靠性。然而，传统的比率型策略通常需要两个独立的发光体，其引入和匹配过程复杂，限制了其应用。相比之下，若单一发光体能够同时发射阴、阳极两种信号，将极大简化比率型传感器的构建。
铱配合物因其优异的量子效率、可调的光物理性质和长寿命等优点，被认为是有前途的电化学发光体。然而，其应用此前大多局限于阳极电化学发光，阴极电化学发光信号较弱，阻碍了其作为双发射单发光体用于比率检测的可能性。另一方面，共反应促进剂如金属纳米颗粒等，被广泛应用于增强电化学发光信号，但已报道的促进剂通常只能增强单一极性的信号，不能同时增强双极信号。因此，开发具有强双极发射的单发光体，并寻找能同时增强双极信号的“双重调控”共反应促进剂，是构建新型单发光体比率型电化学发光传感器亟待解决的问题。
本研究以此为出发点，旨在实现以下目标： 1. 开发一种能够同时发出强阴极和阳极电化学发光信号的铱纳米棒单发光体。 2. 探索能够同时增强上述双极电化学发光信号的共反应促进剂，本研究选择了银纳米颗粒。 3. 结合上述材料和一种基于DNA酶的循环放大策略，构建一种新型的单发光体比率型电化学发光生物传感器。 4. 将所构建的传感器应用于阿尔茨海默病关键生物标志物AβO的高灵敏、高选择性检测，验证其实际应用潜力。
三、 详细工作流程
本研究包含多个紧密衔接的实验步骤，具体工作流程详述如下：
1. 关键材料的制备与表征： 首先，研究人员合成了两种核心纳米材料：铱纳米棒和银纳米颗粒。通过使用聚（苯乙烯-马来酸酐）作为功能试剂，对铱配合物进行调制，成功制备了具有双极电化学发光发射能力的铱纳米棒。扫描电子显微镜表征显示，所制备的Ir NRs呈典型的棒状，平均长度约为650纳米，直径约为78纳米。同时，采用化学还原法制备了银纳米颗粒，透射电子显微镜图像显示Ag NPs呈高度均匀的球形，平均直径约为3.76纳米。X射线光电子能谱和紫外-可见吸收光谱进一步证实了这两种材料的成功合成。
2. 双极电化学发光性质的探究与机理研究： 随后，研究团队系统地研究了Ir NRs的电化学发光行为。通过在含有N,N-二异丙基乙二胺（阳极共反应剂）和过硫酸根离子（阴极共反应剂）的缓冲溶液中，对Ir NRs修饰的电极进行循环伏安扫描和电化学发光信号采集，观测到了分别位于+0.9 V和-2.0 V的强阳极和阴极电化学发光峰。3D和2D电化学发光光谱分析表明，这两个信号的发射波长均在572 nm左右，且与过硫酸根离子自身的发光峰位置（650 nm）明显不同，证实了双信号均来源于Ir NRs本身。此外，研究还探究了Ag NPs作为共反应促进剂的作用。通过比较引入Ag NPs前后Ir NRs的循环伏安和电化学发光-电位曲线，发现Ag NPs的引入使阳极电化学发光的起始电位负移，阴极电化学发光的起始电位正移，并且两种信号的强度均得到显著增强。电子顺磁共振实验直接证明了Ag NPs能促进Dpea生成更多自由基，以及促进S2O8^2-还原生成更多的SO4•−自由基。基于这些结果，论文提出了Ag NPs作为“双重调控”共反应促进剂的作用机理：在阳极扫描过程中，Ag NPs被氧化为Ag+，后者与Dpea反应生成更多的Dpea•+自由基，进而去质子化生成更多还原性自由基，从而增强阳极信号；在阴极扫描过程中，Ag NPs与S2O8^2-之间的电子交换反应促进了SO4•−自由基的生成，进而增强了阴极信号。
3. 三维DNA纳米机器的组装与信号转导： 为了实现目标物AβO的高灵敏度检测，研究设计了一个精巧的三维DNA纳米机器和杂交链式反应级联信号放大策略。首先，将氨基标记的单链S1以及由适配体探针AP、单链W1和W2形成的三链复合结构，通过酰胺反应固定在羧基修饰的磁珠表面，组装成三维DNA纳米机器。当目标物AβO存在时，它会与AP特异性结合并将其从三链复合体中带走，从而“解锁”被封闭的Mg2+依赖性DNAzyme驱动的双足步行器。这些被激活的步行器能够在磁珠表面自主行走并切割固定的单链S1，释放出大量的单链输出产物St。这个过程实现了对目标物的初步识别和信号转换放大。
4. 生物传感器的逐步组装与构建： 传感器的组装在玻碳电极表面逐步进行。首先，将制备好的Ir NRs溶液滴涂到洁净的电极表面，干燥后形成Ir NRs修饰层。然后，通过EDC/NHS交联反应，将氨基标记的发夹探针H1捕获到Ir NRs表面。接着，用牛血清白蛋白封闭电极上剩余的非特异性结合位点。接下来，将上一步三维DNA纳米机器在AβO触发下释放出的输出链St孵育到修饰电极上。St能够识别并切割固定的H1，产生大量的单链S2。最后，引入Ag NPs标记的发夹探针H2和H3。此时，电极表面产生的S2会引发H2和H3之间的杂交链式反应，导致大量标记有Ag NPs的DNA双链在电极表面聚集，从而将众多的Ag NPs引入到传感器界面。每一步修饰后，均通过循环伏安法和电化学阻抗谱监测电极界面的变化，以验证组装过程的成功。
5. 电化学发光测量与分析： 所有电化学发光测量均在含有0.010 mM DPEA和10 mM K2S2O8的磷酸盐缓冲液中进行。使用三电极系统，在-2.0 V至+0.9 V的电位范围内以300 mV/s的扫描速率进行扫描，并同步记录电化学发光强度。通过在一次扫描中同时获取的阴极和阳极电化学发光信号，计算其比值作为最终的检测信号，实现对AβO的比率型检测。
四、 主要研究结果
1. Ir NRs和Ag NPs的表征结果： SEM和TEM图像清晰地展示了Ir NRs的棒状形貌和Ag NPs的均匀球形形貌，尺寸统计结果支持了材料的成功制备。XPS和UV-Vis光谱提供了材料的元素组成和光学性质证据。
2. 双极电化学发光性质与增强机制验证结果： 电化学发光光谱证实了Ir NRs在572 nm处具有双极发射特性，且与共反应剂S2O8^2-的发射波长不同。对比实验（图3a, b）直观显示，在电极表面引入Ag NPs后，阴极和阳极电化学发光信号的起始电位分别向更正值和更负值移动，且信号强度均显著增强。EPR实验（图3c, d）提供了直接证据：在Ag NPs存在下，Dpea•和SO4•−自由基的信号强度均大幅增加，从机理层面证实了Ag NPs对双极共反应过程的促进作用。
3. 生物传感器对AβO的分析性能： 在优化了反应条件（如W1链长度、Mg2+浓度、步行器反应时间、HCR时间）后，传感器对不同浓度AβO的响应如图4所示。随着AβO浓度从1.0 pM增加到10 nM，阴极和阳极的电化学发光强度均逐渐增强。以阴极信号与阳极信号的比值对AβO浓度的对数作图，在1.0 pM至10 nM的范围内呈现良好的线性关系，线性方程为 Icathode/Ianode = 0.1220 lg C + 2.5962，相关系数r = 0.9955。根据3倍信噪比计算，检测限低至0.62 pM。与文献中报道的其他AβO检测方法相比（论文补充材料表S2），该传感器在检测限和线性范围上具有竞争力。
4. 选择性、稳定性与实用性验证结果： 选择性实验（图4d）表明，传感器对高浓度（1.0 × 10^-6 M）的潜在干扰物，如BSA、AFP、CEA、PSA、Aβ单体及Aβ纤维，均未产生明显的信号响应，而仅对1.0 × 10^-8 M的AβO产生强烈的信号变化，显示出优异的选择性。稳定性测试表明，Ir NRs在4°C下储存20天后，电化学发光信号仍能保持初始值的92%以上。所构建的生物传感器在连续扫描15个周期后，信号相对标准偏差为3.1%，表现出良好的稳定性。六个独立制备的传感器对同一浓度AβO检测的RSD为4.2%，证明了较好的重现性。为评估实际应用潜力，研究进行了加标回收实验。向人工脑脊液中添加不同浓度的AβO，测得回收率在93.0%至104%之间，RSD均低于5%，表明该传感器在复杂生物样品基质中具有良好的准确度和精密度。
五、 研究结论与意义
本研究成功开发了一种基于双发射单发光体（Ir NRs）和双重调控共反应促进剂（Ag NPs）的新型比率型电化学发光生物传感平台，并将其应用于阿尔茨海默病生物标志物AβO的高灵敏、高选择性检测。
科学价值： 1. 材料创新： 首次利用PSMA调控铱配合物，成功制备了能同时发出强阴极和阳极电化学发光信号的Ir NRs，极大地拓展了铱配合物在电化学发光领域的应用范围，为解决单发光体比率传感中发光体种类有限的问题提供了新思路。 2. 机制创新： 揭示了Ag NPs作为“双重调控”共反应促进剂，能够同时增强Ir NRs的双极电化学发光信号的机理，这为设计和发展新型的共反应促进剂提供了理论指导和范例。 3. 策略创新： 巧妙地将Ir NRs的双极发射特性、Ag NPs的双重增强效应、以及三维DNA纳米机器的循环放大和HCR级联放大策略相结合，构建了一个性能优异的单发光体比率型电化学发光传感新平台。该策略避免了传统双发光体比率系统的复杂操作，简化了传感界面的构建，同时保留了比率检测抗干扰能力强的优势。
应用价值： 该传感平台为AβO的检测提供了一种灵敏度高、选择性好、操作相对简便的新方法，在阿尔茨海默病的早期临床诊断和病理研究方面具有重要的应用前景。所发展的传感构建策略具有普适性，通过更换识别元件，可推广用于其他疾病标志物、核酸、蛋白质等多种目标物的高精度检测，在生物医学分析、食品安全、环境监测等领域展现出广阔的应用潜力。
六、 研究亮点
七、 其他有价值的内容
论文中还对可能的电化学发光机理进行了详细的推测和讨论（图2），并提供了相应的方程式，这有助于读者深入理解Ir NRs/Dpea和Ir NRs/S2O8^2-两个体系的电化学发光过程，以及Ag NPs在其中发挥促进作用的电子转移路径。此外，补充材料中提供了详细的实验部分、DNA序列、凝胶电泳验证可行性、参数优化过程、与现有方法的对比分析以及传感器稳定性测试数据，使整个研究工作更加完整、严谨和具有可重复性。这些内容共同支撑了研究结论的可靠性。