摘要：本文由来自马来西亚博特拉大学（Universiti Putra Malaysia）食品科学与技术学院食品科学系的N. S. Zainin、K. Y. Lau、M. Zakaria、R. Son、A. F. Abdull Razis以及Y. Rukayadi等人完成，其中Y. Rukayadi为通讯作者，同时隶属于马来西亚博特拉大学生物科学研究所天然产物实验室。该研究发表于《International Food Research Journal》2013年第20卷第6期，页码为3319–3323。研究的核心内容是评价凹唇姜（Boesenbergia rotunda (L.) Mansf. A.）甲醇提取物对大肠杆菌（Escherichia coli）的抗菌活性。
一、研究背景与目的
大肠杆菌是一种常见的食源性致病菌，能够引起人类腹泻等疾病，其中大肠杆菌O157:H7感染可导致严重腹泻甚至肾脏损伤。儿童和老年人更容易出现严重并发症。该菌主要通过摄入受污染的食物传播，如未煮熟的肉类、生菜、未经巴氏消毒的牛奶、果汁或苹果酒等。大肠杆菌O157:H7的感染剂量极低，仅需10–100 CFU/g即可致病。近年来，大肠杆菌对多种常用抗生素产生耐药性，使得由其引起的感染成为全球范围内的重要公共卫生问题。与此同时，消费者对天然产物替代合成抗菌剂的需求不断增加，因为合成抗菌剂可能对人体产生毒性。
凹唇姜（temukunci）是东南亚地区一种重要的药用和烹饪植物，属于姜科（Zingiberaceae），在印度至东南亚地区广泛分布。已有研究表明凹唇姜含有多种活性成分，如boesenbergin、cardamonin、pinostrobin、5,7-dimethoxyflavone、1,8-cineole和panduratin等。此前研究已证实凹唇姜提取物对口腔细菌、肠球菌和葡萄球菌具有较强的抗菌活性，但其对大肠杆菌等食源性致病菌的抗菌活性报道较少。因此，本研究旨在系统评价凹唇姜甲醇提取物对标准大肠杆菌ATCC 25922以及两株从牛奶制品中分离的大肠杆菌O157:H7的抗菌活性。
二、材料与方法
本研究的方法主要包括提取物制备、菌株来源、体外药敏试验、最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration, MIC）和最低杀菌浓度（minimum bactericidal concentration, MBC）测定以及时间-杀菌曲线（time-kill curve）试验。
在提取物制备方面，研究人员将凹唇姜根茎干燥后研磨，用400 mL 100%（v/v）甲醇在室温下提取7天。提取液经Whatman 2号滤纸过滤后，使用旋转蒸发仪在50°C、150 rpm条件下浓缩。提取物用10%二甲基亚砜（dimethylsulfoxide, DMSO）溶解，配制成10 mg/mL（即1%）的储备液。实验证实10% DMSO对所测细菌无杀菌作用。
在菌株方面，研究使用了大肠杆菌ATCC 25922标准菌株，该菌株购自美国典型培养物保藏中心（American Type Culture Collection, Rockville, MD）。另外两株大肠杆菌O157:H7，分别命名为E. coli O157:H7-1和E. coli O157:H7-2，来自马来西亚博特拉大学食品安全与质量实验室，均从牛奶样品中分离获得。所有菌株在Mueller-Hinton肉汤（MHB）或添加1.5%琼脂的Mueller-Hinton琼脂（MHA）培养基中于37°C过夜培养。
体外药敏试验采用纸片扩散法（disc-diffusion method）。将每株菌的过夜培养物用无菌棉签均匀涂布于MHA平板表面。将6 mm无菌纸片浸入10 µL 1%凹唇姜提取物溶液后放置于平板表面，以1%氯己定（chlorhexidine）作为阳性对照。平板在37°C培养24小时后观察抑菌圈直径（包括纸片直径）。每个试验重复两次。
MIC测定按照临床和实验室标准协会（Clinical and Laboratory Standard Institute, CLSI）M7-A6指南进行。在96孔圆底微量滴定板中采用标准肉汤微量稀释法，接种菌量约为10⁶ CFU/mL。将凹唇姜提取物或氯己定进行二倍稀释，与受试菌在MHB培养基中混合。第12列含最高浓度提取物或氯己定，第3列为最低浓度。第2列作为阳性对照（仅含培养基和菌液，不加抗菌剂），第1列为阴性对照（仅含培养基）。微量滴定板在37°C有氧条件下培养24小时。MIC定义为能完全抑制可见细菌生长的最低抗菌剂浓度。MBC定义为在MHA平板上无细菌生长的最低抗菌剂浓度。将各孔（包括阳性和阴性对照孔）取10 µL悬液接种于MHA平板，37°C培养24小时或直至阳性对照孔出现生长。
时间-杀菌曲线试验参考Lorian（2005）和Pankey与Ashcraft（2009）的方法并进行改良。将调整后的菌悬液（5×10⁷ CFU/mL）以1:10稀释于MHB中，最终菌浓度为5×10⁶ CFU/mL。凹唇姜提取物以1:10稀释于含菌MHB中，使初始菌量为4.5×10⁶ CFU/mL。提取物终浓度分别为0× MIC、0.5× MIC、1× MIC和2× MIC。培养物（终体积5 mL）于37°C、200 rpm振荡培养。在预设时间点（0、30分钟以及1、2、4小时）取100 µL样品，离心（3900 rpm，4°C，1分钟），用900 µL无菌蒸馏水洗涤两次以去除提取物。将沉淀重悬于10 mL MHB中并进行系列稀释。取适量（25、50或100 µL）涂布于MHA平板，37°C培养48小时或更长时间直至菌落出现，计算CFU/mL。每个试验独立重复三次。
三、主要结果
纸片扩散法结果显示，1%凹唇姜提取物对大肠杆菌ATCC 25922、E. coli O157:H7-1和E. coli O157:H7-2的抑菌圈直径分别为9.0 mm、7.0 mm和7.0 mm。抑菌圈越大表示抗菌活性越强，因此凹唇姜提取物对标准菌株ATCC 25922的抑制效果优于两株从牛奶中分离的O157:H7菌株。此前研究报道这两株O157:H7具有抗生素耐药性，而牛奶来源的大肠杆菌也常对氨苄西林和氯霉素耐药。尽管如此，凹唇姜提取物对两株O157:H7仍表现出抑制作用。
MIC和MBC测定结果显示，凹唇姜提取物对大肠杆菌ATCC 25922的MIC为0.019 mg/mL，MBC为0.039 mg/mL；对E. coli O157:H7-1和E. coli O157:H7-2的MIC均为2.5 mg/mL，MBC均为5.0 mg/mL。这一结果进一步证明两株O157:H7具有比标准菌株更强的耐药性。但与丁香提取物相比（其对大肠杆菌O157:H7的MIC为10 mg/mL），凹唇姜提取物对耐药大肠杆菌仍显示出更强的抗菌活性。
在时间-杀菌曲线试验中，凹唇姜提取物在1× MIC浓度下即可使所有受试大肠杆菌的CFU/mL下降≥3 log单位（即减少99.9%），表现出快速杀菌作用。在2× MIC浓度下，所有大肠杆菌菌株在2小时内达到杀菌终点，即培养2小时后无菌落生长。具体而言，大肠杆菌ATCC 25922在0.038 mg/mL（2× MIC）处理2小时后被完全杀死；E. coli O157:H7-1和E. coli O157:H7-2在5 mg/mL（2× MIC）处理2小时后被完全杀死。这些结果表明凹唇姜提取物对大肠杆菌具有快速且有效的杀菌活性。
四、结论与意义
本研究证实凹唇姜甲醇提取物对大肠杆菌标准菌株和耐药菌株均具有抗菌活性。其MIC范围为0.019–2.5 mg/mL，MBC范围为0.039–5.0 mg/mL。在2× MIC浓度下，凹唇姜提取物可在2小时内杀死所有受试大肠杆菌菌株。这表明凹唇姜提取物具有作为抗食源性致病菌天然抗菌剂的潜力。
从科学价值来看，本研究为凹唇姜提取物抗大肠杆菌活性提供了系统的体外实验数据，填补了该领域的研究空白。此前对凹唇姜抗菌活性的研究多集中于口腔细菌、葡萄球菌和肠球菌，而本研究将对象扩展至重要的食源性致病菌大肠杆菌，尤其是具有抗生素耐药性的O157:H7菌株。从应用价值来看，凹唇姜作为一种天然植物提取物，有望在食品保鲜和食品安全控制中发挥替代合成防腐剂的作用，降低合成抗菌剂对人体健康的潜在风险。
五、研究亮点
本研究的亮点在于：第一，系统评价了凹唇姜提取物对标准菌株和临床耐药菌株的抗菌活性，并同时测定了MIC、MBC和时间-杀菌曲线，从抑菌和杀菌两个层面全面反映了提取物的抗菌特性。第二，时间-杀菌曲线结果显示凹唇姜提取物在2× MIC浓度下2小时内即可完全杀死大肠杆菌，说明其杀菌作用快速，具有较强的实际应用潜力。第三，研究对象包括从牛奶中分离的抗生素耐药大肠杆菌O157:H7，这对评估天然提取物在食品安全领域的应用具有重要参考价值。
此外，研究还指出，未来可进一步研究凹唇姜提取物对其他食源性致病菌如金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、鼠伤寒沙门菌（Salmonella typhimurium）、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）和副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）的抗菌活性，以拓展其应用范围。该研究由马来西亚博特拉大学研究型大学资助计划（RUGS）资助，项目编号为02-05-11-1586RU（2011）。