2022年3月3日，《自然》（*Nature*）期刊在线发表了一项关于拉沙病毒（Lassa virus, LASV）的重要研究，题为“Structure and receptor recognition by the Lassa virus spike complex”。该研究由以色列魏茨曼科学研究所（Weizmann Institute of Science）的Ron Diskin课题组领衔，主要作者包括Michael Katz, Jonathan Weinstein, Maayan Eilon-Ashkenazy等。
学术背景： 拉沙病毒是一种高致病性的沙粒病毒，在西非地区流行，可引起严重的拉沙出血热，其致死率高且目前缺乏特效疗法。与其他沙粒病毒类似，拉沙病毒的表面呈现由糖蛋白前体（Glycoprotein precursor, GPC）加工而成的I类刺突复合体，该复合体负责识别宿主细胞受体并介导病毒入侵。已知拉沙病毒利用宿主细胞表面的α-肌营养不良聚糖（α-dystroglycan, α-DG）作为其主要受体，而α-DG上的修饰性线性多糖——基质葡聚糖（Matriglycan）是病毒结合的关键。然而，拉沙病毒识别基质葡聚糖的精确分子机制尚不明确。此外，沙粒病毒刺突复合体包含一个独特的稳定信号肽（Stable signal peptide, SSP），它在成熟刺突中扮演着不可或缺的功能角色，但其在膜中的确切拓扑结构、构象和作用机制存在争议。因此，解析完整的、近乎天然的拉沙病毒刺突复合体结构，对于阐明其受体识别机制、理解SSP的功能以及指导新型抗病毒药物的设计，具有迫切而重要的科学意义。本研究旨在通过冷冻电镜技术，解析拉沙病毒完整的天然刺突复合体结构，揭示其识别基质葡聚糖的分子细节，并阐明SSP在稳定刺突构象中的拓扑结构和作用机制。
详细工作流程： 本研究是一个典型的基于结构生物学的综合性研究，工作流程可分为以下几个关键环节：
1. 蛋白表达与纯化： 研究团队在HEK 293F细胞中表达了拉沙病毒（Josiah株）全长的GPC，并在其C端融合了一个Flag标签。转染48小时后，收集细胞膜组分。利用含有去污剂DDM和CHS的缓冲液将膜蛋白溶解，然后通过亲和层析，使用抗Flag珠捕获溶解的刺突复合体。为了获得适用于冷冻电镜的单颗粒样品，在洗脱前逐步用更温和的去污剂LMNG替换DDM/CHS，并用Flag肽竞争性洗脱得到纯化的刺突复合体蛋白。
2. 冷冻电镜数据收集与处理： 将纯化的蛋白样品应用于石墨烯氧化物包被的铜载网上，使用Titan Krios冷冻电镜在300 kV下采集数据。共收集了4,072张电影图像。数据处理使用CryoSPARC v3软件套件进行。首先进行运动校正和对比度传递函数（CTF）估计。通过Blob picking自动挑选出约1.2百万个颗粒。经过多轮二维分类、三维分类（使用C1对称性）和*ab initio*建模等步骤，最终筛选出91,903个高质量的颗粒，用于在施加C3对称性的条件下进行三维重构，获得了整体分辨率为2.5 Å（根据金标准FSC）的密度图。考虑到密度图质量，最终将其低通滤波至3.3 Å用于模型构建。为了更清晰地观察受体结合区域的细节，研究团队还使用另外234,687个颗粒，分别进行了局部的C3对称性重建和C1对称性重建，获得了聚焦于胞外域的高分辨率密度图。
3. 模型构建、修正与SSP注册确定： 初始模型是将Hastie等人此前解析的拉沙病毒刺突变性结构域模型（PDB: 5vk2）对接到整体密度图中获得的。随后，使用Coot和Phenix进行手动的模型完善和实空间精修，构建了包括胞外域和跨膜区的完整刺突复合体原子模型。然而，对于SSP跨膜区的主链走向（即氨基酸序列在螺旋上的起始位置，称为“注册”）在密度图中无法直接明确判断。为了解决这一关键问题，研究团队采用了基于Rosetta软件的无偏计算建模方法。具体流程是：首先将跨膜区嵌入一个虚拟膜环境；然后，在固定中央GP2跨膜螺旋注册的前提下，系统地尝试SSP序列所有可能的37种注册位置以及两种跨膜方向（N端朝外或C端朝外）。对于每一种可能性，利用Rosetta的膜蛋白能量函数（该函数综合考虑了范德华力、氢键、静电作用和膜深度依赖性溶剂化效应）进行侧链打包和主链/侧链的能量最小化。通过比较所有模型的计算能量，最终确定了能量最低且显著优于其他可能性的唯一SSP注册方案（即第一个疏水区跨膜，且N端位于胞外区）。这一计算建模结果为SSP的精确建模提供了强有力的支持。
4. 生化与功能验证实验： 为了证实结构观察到的密度对应于基质葡聚糖，并探究其生物学意义，研究进行了多项生化与细胞实验： - 基质葡聚糖检测： 利用抗基质葡聚糖的特异性单克隆抗体IIH6，通过免疫共沉淀和斑点印迹实验，验证了纯化的拉沙病毒刺突复合体上结合有基质葡聚糖，而作为对照的利用转铁蛋白受体1（Tfr1）的马秋波病毒（Machupo virus, MACV）刺突复合体则没有。 - 假病毒感染抑制实验： 使用携带拉沙病毒或MACV刺突的鼠白血病病毒（MLV）假病毒颗粒，在感染靶细胞时添加体外合成的基质葡聚糖。通过检测报告基因荧光素酶的活性，评估基质葡聚糖对病毒感染的竞争性抑制作用。 - 假病毒耗竭实验： 将IIH6抗体偶联到蛋白L磁珠上，用来孵育携带拉沙病毒或卢约病毒（Lujo virus, LUJV，使用神经纤毛蛋白-2受体）刺突的假病毒颗粒。随后通过RT-qPCR定量上清液中残留的病毒RNA，验证了拉沙病毒假病毒颗粒表面存在基质葡聚糖，并能被IIH6特异性耗竭。 - 序列比对与保守性分析： 对多种沙粒病毒（包括旧世界组、新世界组等）的GPC序列进行了比对，分析了SSP和GP1受体结合相关残基的保守性，以支持结构观察到的功能区域重要性。
主要研究结果：
1. 拉沙病毒刺突复合体的整体结构与SSP的膜拓扑： 解析的结构显示，拉沙病毒刺突复合体是一个三聚体，每个原体由SSP、GP1（受体结合域）和GP2（膜融合域）组成。在跨膜区观察到一个由六条跨膜螺旋组成的束，其中中央三条属于GP2，外围三条属于SSP。通过计算建模和密度图分析，明确证实SSP的N端位于胞外区，其第一个疏水区形成跨膜螺旋，而非之前有模型提出的双次跨膜（bitopic）拓扑。SSP起始于一段短螺旋（H1），大致平行于膜平面并可能部分嵌入膜中，随后由高度保守的Pro12作为螺旋破坏者，引导跨膜螺旋（H2）以约70度的角度插入脂双层。高度保守的Lys33位于SSP跨膜螺旋的末端，朝向细胞质。这一拓扑结构与许多已有的生化数据吻合，例如Cys57参与锌离子配位，以及“正电荷在内规则”。
2. 双端域交换机制稳定刺突三聚体： 研究发现，天然刺突的稳定性归功于一种独特的“双端域交换”机制。在刺突的顶端（远端），一个原体的GP1亚基的C末端（包含RRLL基序）交换并插入相邻原体GP1亚基形成的口袋中，通过Tyr150、Leu258等残基的疏水和极性相互作用锁定。在靠近膜的另一端（近端），GP2亚基的长α螺旋（H5）也发生交换，伸向相邻的原体，并与对方的H5相互作用，形成一个相互缠绕的螺旋对。这种GP2的H5交换又被外围的SSP所稳定，SSP的跨膜螺旋填充在GP2螺旋之间的凹槽中，其胞外的H1也与相邻的GP2发生疏水相互作用（如Phe7, Val11）和极性相互作用（如Glu16-Arg422）。顶端和近端的域交换具有相反的方向性，如同糖果包装纸两端的反向拧转，从而极大地增强了三聚体的稳定性。这解释了为何此前需要抗体“钉合”的截短突变体不稳定，而本研究中的天然全长刺突在去污剂中却能保持稳定。
3. 基质葡聚糖的识别机制： 这是本研究的核心发现。在结构顶端的GP1三聚体界面处，发现了三个对称的深口袋，每个口袋内都有清晰的 elongated 密度。这些密度的形状和大小与基质葡聚糖的重复单元[-Xyl-α1,3-GlcA-β1,3-Xyl-]完美契合。通过高分辨率的局部分类重构（C1对称），进一步揭示这三个对称位点实际上被一条连续的、线性的基质葡聚糖链所占据。研究人员成功建模了总共13个糖单体：三个对称位点各有一个Xyl-GlcA-Xyl三糖单元，它们通过额外的连接GlcA单元（在不对称位点）连接成一条单链，链的末端还有一个Xyl单元。 详细的相互作用分析表明，识别主要由多重的极性相互作用驱动：中心GlcA的羧基与Arg257的主链酰胺和胍基形成盐桥和氢键；Arg257还与糖苷键和Xyl的羟基相互作用；Tyr150与GlcA形成疏水接触；Arg256也与Xyl的羟基作用。此外，连接处的GlcA羧基作为N端帽，与Leu120和Ser121的主链酰胺形成氢键。GP1 C末端的RRLL基序（SKI-1蛋白酶切割位点）在形成结合口袋中起着关键作用，其Arg257直接参与结合。这解释了为什么单体GP1不能结合α-DG，以及为何α-DG嗜性沙粒病毒的该残基高度保守，而Tfr1嗜性病毒则不保守。研究还指出，一条线性多糖链与一个三聚体蛋白的多种可能结合模式（简并态）可能有助于降低结合的熵罚，提高亲和力。
4. 基质葡聚糖的生物学意义：预载与病毒释放 生化实验表明，从细胞纯化的刺突复合体上结合的基质葡聚糖是非共价连接的、游离的多糖链，而非连接在α-DG蛋白上。功能实验证明，过量的游离基质葡聚糖可以竞争性抑制拉沙病毒假病毒对细胞的感染。基于这些发现，研究提出了一个新颖的模型：病毒在宿主细胞的高尔基体等腔室中组装时，其刺突复合体可能“预载”了细胞中存在的游离基质葡聚糖链。当新生成的病毒颗粒离开细胞，进入细胞外低浓度游离基质葡聚糖的环境时，这些预载的基质葡聚糖会逐渐解离。在这个过程中，预载的基质葡聚糖作为一种竞争性抑制剂，暂时性地降低了病毒颗粒对其产生细胞或邻近细胞的再附着能力，从而为病毒提供了一个逃离感染源细胞的“机会窗口”，促进了病毒的有效释放（egress）。一旦预载的基质葡聚糖解离完毕，病毒表面暴露出高亲和力的受体结合位点，便能高效地通过多价效应（avidity）结合到新靶细胞表面密集的基质葡聚糖上。
结论与意义： 本研究成功解析了拉沙病毒完整、天然的刺突复合体高分辨率冷冻电镜结构，取得了多项突破性发现： 1. 明确了SSP的膜拓扑结构：SSP为单次跨膜，N端胞外，解决了长期存在的争议，并揭示了其通过锁定GP2跨膜螺旋来稳定三聚体的结构基础。 2. 揭示了双端域交换的稳定机制：解释了天然刺突复合体何以在恶劣环境中保持稳定。 3. 阐明了基质葡聚糖的精确识别机制：首次在原子水平展示了拉沙病毒如何利用其刺突顶端的复合口袋结合一条连续的基质葡聚糖链，详细描绘了关键相互作用网络。 4. 提出了“预载-机会窗口”的病毒释放新模型：将结构生物学发现与病毒生命周期联系起来，为理解沙粒病毒的释放过程提供了新视角。
这项研究的科学价值在于，它填补了我们对高致死性拉沙病毒入侵机制认识的关键空白，为理解α-肌营养不良聚糖嗜性沙粒病毒的受体识别提供了范式。其应用价值体现在为基于结构的合理药物设计奠定了坚实基础，例如，可以针对新发现的基质葡聚糖结合口袋或SSP-GP2相互作用界面，设计小分子抑制剂、多肽或新型抗体，以阻断病毒附着或膜融合过程。此外，研究也提示，对病毒刺突蛋白进行工程化改造（如引入弗林蛋白酶位点）可能会破坏其天然稳定性和受体结合位点，这在疫苗设计和基础研究中需予以考虑。
研究亮点： 1. 研究对象和方法的“原生性”：研究使用了最小化修饰的全长蛋白，在去污剂中保持了天然构象，从而捕捉到了此前截短或突变体研究中丢失的关键结构特征，如完整的域交换和预载的受体。 2. 关键技术的创新性应用：结合高分辨率冷冻电镜单颗粒分析与Rosetta无偏计算建模，精准确定了SSP在密度图不佳区域的注册和拓扑，展示了计算与实验结构生物学联用的强大力量。 3. 突破性发现：连续线性基质葡聚糖链以单链形式结合在三聚体刺突上的发现，以及由此引申出的病毒预载受体辅助释放的生物学模型，极具原创性和启发性。 4. 系统性与完整性：研究从结构解析出发，通过严谨的生化和功能实验验证结构发现，并深入探讨了其生物学意义，构成了一个完整的研究闭环。