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一、研究作者、机构与发表信息

本文题为《Exploring the therapeutic potential of SIRT6-enriched adipose stem cell-derived exosomes in myocardial ischemia–reperfusion injury: unfolding new epigenetic frontiers》，发表于 Clinical Epigenetics 期刊，2024年第16卷，文章编号为7。论文通讯作者为韩彦硕（Yanshuo Han），其所属机构为大连理工大学生命与医药学院。第一作者为刘坤（Kun Liu）与王鹤程（Hecheng Wang），二人被标注为共同第一作者（contributed equally to this work）。刘坤来自贵州医科大学附属医院心脏外科，王鹤程来自大连理工大学生命与医药学院。其他作者分别来自大连理工大学、北部战区总医院麻醉科、上海交通大学医学院附属第九人民医院血管外科。

二、研究背景

本研究聚焦于心肌缺血再灌注损伤（myocardial ischemia–reperfusion injury, MIRI）的治疗策略。MIRI是冠状动脉旁路移植术（CABG），尤其是非体外循环下CABG（OPCAB）后常见的并发症。在手术中，为了保证血管吻合的清晰视野，冠状动脉需暂时阻断，术后恢复血流时引发的氧化应激与活性氧（reactive oxygen species, ROS）过量产生，会破坏细胞内蛋白质聚集体与受损细胞器的修复-清除平衡，最终激活细胞死亡通路。

SIRT6（sirtuin 6）是一种NAD⁺依赖性去乙酰化酶，在代谢、DNA修复、炎症调控及线粒体功能维持中发挥重要作用。已有研究显示，SIRT6在心血管疾病和MIRI中具有抗氧化、抗炎与抗凋亡特性。外泌体（exosomes）是由几乎所有细胞类型释放的胞外囊泡，可携带蛋白质、脂质、mRNA、miRNA等多种生物活性分子，介导细胞间的通讯。间充质干细胞（MSCs），尤其是脂肪干细胞（adipose-derived stem cells, ASCs），具有强外泌体分泌能力，且可通过基因修饰增强外泌体的特定功能。

本研究旨在探索SIRT6富集的脂肪干细胞来源外泌体（SIRT6-enriched ASC-derived exosomes, S-ASC-exo）对MIRI的治疗作用，重点考察其对AIM2介导的焦亡（AIM2-pyroptosis）与线粒体自噬（mitophagy）的调控，以及在体外缺氧/复氧（anoxia/reoxygenation, AR）模型与体内大鼠MIRI模型中的心脏保护效应。

三、研究流程与方法

本研究可分为生物信息学分析、外泌体制备与表征、体外实验、体内实验以及机制验证五个主要部分。

1. 生物信息学分析

研究团队利用高通量测序数据集GSE130217，比较了年轻（3–4个月）与老年（24–26个月）C57BL/6J小鼠在MIRI后的基因表达谱。对差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs）进行筛选，标准为校正p值小于0.05且绝对log2倍变化（|logFC|）≥1.0。在SIRT家族中，SIRT2、SIRT3、SIRT4、SIRT5与SIRT6在MIRI组织中均表达下调。进一步根据与线粒体自噬和焦亡相关基因的交叉分析，确定SIRT2和SIRT6为关键调控因子，并构建了蛋白质相互作用网络。免疫浸润分析使用CIBERSORTx工具，评估了13种免疫细胞类型的比例及其与SIRT2/SIRT6表达的相关性。

2. 外泌体的制备与表征

从雄性Sprague Dawley（SD）大鼠脂肪组织中分离ASCs，并用携带SIRT6与绿色荧光蛋白（GFP）的慢病毒载体转染，以获得稳定过表达SIRT6的S-ASCs。外泌体通过ExoQuick-TC™沉淀法或超速离心法从条件培养基中分离。透射电子显微镜（TEM）观察其形态，Western blot检测外泌体标志蛋白CD9、CD63、CD81及阴性标志Calnexin。PKH67荧光标记用于示踪外泌体被H9c2心肌细胞摄取的情况。

3. 体外AR模型与细胞实验

H9c2大鼠心肌细胞在无氧（95% N₂，5% CO₂）低糖培养基中培养2小时，再转移至常氧高糖培养基中培养1小时，以模拟体内缺血再灌注损伤。实验分为多个处理组：Sham（PBS，无AR）、Control（PBS）、ASC-exo（普通ASCs外泌体）、S-ASC-exo（SIRT6富集外泌体）、siSIRT6（靶向SIRT6的siRNA）、VX-765（caspase-1抑制剂）及3-MA（3-甲基腺嘌呤，线粒体自噬抑制剂）。通过MTT法检测细胞活力，LDH释放试验评估细胞损伤。qRT-PCR与Western blot检测SIRT6、AIM2、GSDMD、caspase-1、p62与Beclin-1的表达。

4. 体内MIRI模型

SD大鼠被随机分为Sham组、Control组与S-ASC-exo组，每组6只。大鼠通过结扎左前降支（LAD）冠状动脉30分钟后恢复血流建立MIRI模型。S-ASC-exo在MIRI前1小时通过尾静脉注射。术后第3天进行超声心动图检测射血分数（EF%）与短轴缩短率（FS%）。处死大鼠后，心肌组织行HE染色、Masson三色染色、Evans蓝/TTC染色以评估梗死面积。心肌组织的SIRT6、AIM2、GSDMD、p62与Beclin-1蛋白表达通过Western blot检测。

5. 机制验证

为验证S-ASC-exo通过SIRT6发挥作用，研究者在AR模型中联合使用siSIRT6沉默SIRT6，观察其对细胞活力、LDH释放及AIM2/GSDMD/p62/Beclin-1表达的影响。为验证AIM2-pyroptosis通路，使用VX-765抑制caspase-1，观察其对siSIRT6诱导的焦亡的逆转效果。为验证线粒体自噬通路，使用3-MA，观察其对S-ASC-exo促线粒体自噬效应的阻断作用。

四、主要结果

1. 生物信息学结果

在MIRI样本中，SIRT2、SIRT3、SIRT4、SIRT5与SIRT6表达均显著下调，其中SIRT6与线粒体自噬相关基因SQSTM1（p62）、Beclin-1及焦亡相关基因NLRP3存在网络关联。GO与KEGG富集分析显示差异基因主要富集于细胞因子介导的信号通路、趋化因子信号通路及ECM-受体相互作用等通路。

2. 外泌体特征与转染效率

S-ASCs表达GFP荧光，其分泌的外泌体形态呈盘状膜囊泡，CD9、CD63、CD81阳性，Calnexin阴性。PKH67标记外泌体可被H9c2细胞摄取。与未转染组相比，转染SIRT6后，S-ASCs、S-ASC-exo及摄取S-ASC-exo的H9c2细胞中SIRT6 mRNA与蛋白水平均显著升高。

3. S-ASC-exo抑制AIM2-焦亡并促进线粒体自噬

在AR处理后的H9c2细胞中，LDH水平显著升高，细胞活力显著下降。与Control组相比，S-ASC-exo处理显著降低LDH水平并提高细胞活力，而普通ASC-exo无此效应。qRT-PCR与Western blot结果显示，AR后AIM2与GSDMD表达升高，p62与Beclin-1表达下降。S-ASC-exo处理可降低AIM2与GSDMD表达，同时升高p62与Beclin-1表达。

4. siSIRT6逆转S-ASC-exo的心脏保护作用

与S-ASC-exo组相比，S-ASC-exo+siSIRT6组LDH水平升高，细胞活力下降。同时，siSIRT6降低了SIRT6、p62、Beclin-1的表达，升高了AIM2与GSDMD的表达，表明SIRT6是S-ASC-exo介导心肌保护的关键分子。

5. VX-765部分逆转siSIRT6诱导的焦亡

与siSIRT6组相比，siSIRT6+VX-765组caspase-1与GSDMD表达显著降低，LDH释放减少，细胞活力恢复。这表明siSIRT6诱导的细胞损伤部分依赖于caspase-1/GSDMD介导的焦亡通路。

6. 3-MA部分阻断S-ASC-exo的线粒体自噬促进作用

与S-ASC-exo组相比，S-ASC-exo+3-MA组p62与Beclin-1表达显著下降，LDH水平升高，细胞活力降低。这说明S-ASC-exo的心肌保护作用部分通过增强线粒体自噬实现。

7. 体内实验结果

TEM显示，Control组心肌细胞出现大量细胞膜溶解，而S-ASC-exo组细胞膜完整，并可见典型的线粒体自噬结构。HE染色显示Control组心肌排列紊乱、核溶解、胞质深染及炎症细胞浸润，S-ASC-exo组组织学损伤明显减轻。Masson染色显示S-ASC-exo组胶原沉积与纤维化区域减少。Western blot显示，与Control组相比，S-ASC-exo组心肌组织中SIRT6、p62、Beclin-1表达升高，AIM2与GSDMD表达降低。超声心动图显示，Control组EF%与FS%均下降，而S-ASC-exo组心功能显著改善。Evans蓝/TTC染色显示，S-ASC-exo组梗死面积/危险区面积比值（IS/AAR）显著小于Control组。

五、结论与意义

本研究证明SIRT6富集的脂肪干细胞外泌体对MIRI具有显著的心脏保护作用。其机制涉及抑制AIM2介导的焦亡与增强线粒体自噬。S-ASC-exo通过传递SIRT6至心肌细胞，降低AIM2与GSDMD表达，抑制caspase-1/GSDMD依赖的焦亡通路；同时上调p62与Beclin-1，促进线粒体自噬，清除受损线粒体，减少ROS产生，从而保护心肌细胞。体内实验进一步证实S-ASC-exo可改善心功能、减少梗死面积并减轻组织学损伤。

本研究为MIRI的治疗提供了新的表观遗传学视角与外泌体基因工程策略，提示SIRT6富集外泌体有望成为缺血再灌注损伤及心血管疾病的新型治疗手段。

六、研究亮点

本研究的亮点包括：首次将SIRT6基因工程修饰的脂肪干细胞外泌体用于MIRI治疗，并将其保护机制同时关联到AIM2-pyroptosis与线粒体自噬两条关键通路；通过siSIRT6、VX-765与3-MA等多种抑制剂组合实验，系统验证了SIRT6在其中的核心地位；体外AR模型与体内大鼠MIRI模型相互印证，结果一致；生物信息学分析与实验验证相结合，从大数据角度筛选出SIRT6作为关键靶点。

七、其他有价值内容

作者在讨论中指出了研究的若干局限，包括过度的线粒体自噬可能导致正常心肌细胞丢失、SIRT6调控AIM2-焦亡与线粒体自噬的具体分子机制尚未完全阐明、外泌体在体内的定位未被追踪，以及除SIRT6外的其他外泌体内容物也可能参与心脏保护等。此外，作者强调，未来研究需探索PINK1/Parkin、BNIP3、NIX等线粒体自噬受体介导途径在S-ASC-exo诱导效应中的作用。在临床转化方面，该研究为开发基于外泌体的无创性心脏保护策略提供了重要的实验依据。