本研究由北京中医药大学东直门医院的于博睿、周梦琪、董兆程、郑慧娟、赵玉雪、周经纬、张超、魏福东、于国勇、刘伟敬、刘红芳及北京中医药大学的王耀献等学者共同完成。其中于博睿与周梦琪为共同第一作者，王耀献为通讯作者。该研究发表于 Pharmaceutical Biology 期刊2023年第61卷第1期，第1222至1233页，并于2023年2月24日投稿，2023年6月2日修回，2023年7月23日被接收。
糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病常见的微血管并发症之一，约有20%至40%的糖尿病患者会发展为DN，且DN已成为全球终末期肾病（end-stage renal disease，ESRD）的主要病因。随着全球糖尿病患者人数在2021年已超过5.37亿，糖尿病相关终末期肾病的发病率在中国持续上升，寻找有效的DN防治手段成为现代医学面临的重大挑战。
DN的病因复杂，涉及遗传易感性、高血糖、高脂血症、高血压、肾血流动力学改变及血管活性物质代谢异常等多种因素。近年来，传统中药（traditional Chinese medicine，TCM）因其多通道、多靶点的作用机制在DN治疗中日益受到重视。改良肾炎防衰方（modified Shen-Yan-Fang-Shuai formula，M-SYFSF）是在肾炎防衰方（SYFSF）基础上化裁而来的临床经验方，由黄芪、当归、海藻、鳖甲、牡蛎、三七、熟地黄七味中药按30:10:10:10:15:3:30的比例组成。既往研究表明SYFSF可通过抑制肿瘤坏死因子-α/核因子κB（TNF-α/NF-κB）通路减轻糖尿病大鼠的肾脏炎症损伤，但M-SYFSF在延缓DN进展尤其是肾小管损伤方面的具体机制尚不明确。
本研究旨在通过网络药理学分析与体内外实验验证相结合的策略，系统阐明M-SYFSF治疗DN的潜在分子机制，为其临床应用提供科学依据。
本研究整体包含四个主要环节：网络药理学分析、药物成分鉴定与分子对接、体内动物实验验证以及体外细胞实验验证。
网络药理学分析是研究的第一阶段。研究团队首先利用中药系统药理学数据库与分析平台TCMSP和SymMap数据库，按照口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和类药性（drug-likeness，DL）≥0.18的筛选标准，收集M-SYFSF中七味中药的主要活性化合物及其对应的蛋白靶点。对于鳖甲和牡蛎，由于数据库信息有限，研究者通过Similarity Ensemble Approach（SEA）平台获取其活性成分在体内作用的基因靶点，并利用UniProt数据库对蛋白靶点进行规范化处理。同时，研究团队使用GeneCards数据库以“diabetic nephropathy”和“diabetic kidney disease”为关键词检索DN相关疾病基因。将药物靶点与疾病基因取交集后，共获得332个重叠基因。随后利用STRING数据库构建蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络，并将数据导入Cytoscape 3.8.2软件进行拓扑分析，以节点度值超过平均值（33.897）为标准筛选核心靶点，最终识别出PTGS2、AKT1、IL6、TP53和TNF为核心靶点。为了进一步预测M-SYFSF治疗DN的生物学功能与信号通路，研究者利用Omicshare平台和DAVID数据库对重叠基因进行了基因本体（Gene Ontology，GO）富集分析和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析。
药物成分鉴定与分子对接是第二阶段。研究者对M-SYFSF冻干粉进行超高效液相色谱-串联质谱（UHPLC-MS/MS）分析，在正负离子模式下共鉴定出七种生物活性化合物，包括槲皮素（quercetin）、毛蕊异黄酮（calycosin）、熊竹素（jaranol）、9-十八烯酸、11-十二碳二烯酸、芒柄花素（formononetin）和DIOP。结合网络药理学结果，确定槲皮素、毛蕊异黄酮和芒柄花素为核心化合物。随后，研究者从PubChem数据库下载核心化合物的二维结构，通过Chem3D软件转换为三维结构并保存为配体文件；从PDB数据库下载核心靶点ERK、JNK和p38MAPK的三维结构，利用CB-Dock平台进行分子对接验证。
体内动物实验是第三阶段。研究者选用60只雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠（6-8周龄，体重180-200g），随机分为假手术组和手术组，每组各30只。DN模型采用单侧肾切除联合链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）腹腔注射的方法构建：手术组大鼠先接受单侧肾切除术以诱导高滤过和高灌注状态，术后一周给予一次性腹腔注射STZ（50mg/kg）。以连续两次随机血糖水平>16.7mmol/L为模型成功标准。造模成功后，大鼠被随机分为模型组（给予生理盐水3mL/天，n=15）和模型+M-SYFSF组（给予M-SYFSF 11.34g/kg/天，n=15）；假手术组大鼠随机分为假手术组（给予生理盐水，n=15）和假手术+M-SYFSF组（给予M-SYFSF 11.34g/kg/天，n=15）。药物干预持续12周。每四周收集24小时尿液检测尿白蛋白排泄量，干预结束后检测血清肌酐和随机血糖水平，并对肾组织进行苏木精-伊红（H&E）染色、Masson染色和过碘酸雪夫（PAS）染色以观察肾脏病理改变，同时通过免疫组织化学染色检测I型胶原（collagen I）表达，通过蛋白质印迹法（Western blot）检测α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达水平。
体外细胞实验是第四阶段。研究者选用人近端肾小管上皮细胞HK-2，以100μg/mL的晚期糖基化终末产物（advanced glycation end-products，AGEs）处理48小时构建DN细胞模型。首先通过CCK-8法筛选M-SYFSF的安全浓度范围（0-300μg/mL）和最佳作用时间（48小时），再筛选对AGEs处理HK-2细胞的最佳治疗浓度，最终确定100、150和200μg/mL作为低、中、高三个干预浓度。随后通过Western blot检测MAPK信号通路相关蛋白JNK、p38MAPK、ERK及其磷酸化形式（p-JNK、p-p38MAPK、p-ERK）的表达水平，以及炎症因子IL-6、IL-1β和TNF-α的表达。
网络药理学分析结果显示，GO富集分析表明M-SYFSF的作用模式主要涉及线粒体电子呼吸链转运、细胞对药物和刺激的应答、炎症反应、氧化还原过程以及细胞增殖、代谢和死亡等生物学过程。KEGG通路富集分析显示，重叠基因显著富集于氧化磷酸化、代谢通路、TNF信号通路、NOD样受体信号通路、Toll样受体信号通路、T细胞受体信号通路、MAPK信号通路、Ras信号通路、胰岛素抵抗及胰岛素信号通路等多条通路，其中MAPK信号通路被确定为核心通路。
分子对接结果表明，槲皮素、毛蕊异黄酮和芒柄花素与MAPK信号通路核心靶点ERK、JNK和p38MAPK的结合能均低于-5 kcal/mol（例如槲皮素与p38MAPK的结合能为-8.7 kcal/mol，毛蕊异黄酮与ERK的结合能为-8.5 kcal/mol），显示出较强的结合活性，提示M-SYFSF可能通过调控MAPK通路发挥延缓DN进展的作用。
体内实验结果显示，模型组大鼠血糖水平（32.95±0.80 mmol/L）显著高于假手术组（6.76±0.71 mmol/L，p<0.01），血清肌酐（118.70±49.57 vs. 9.03±2.15 μmol/L，p<0.01）、24小时尿白蛋白（111.78±4.28 vs. 16.00±2.47 mg）和尿白蛋白肌酐比值（urine albumin-creatinine ratio，UACR）（53.94±16.01 vs. 7.18±2.46 μg/μmol）均显著升高，表明DN模型构建成功。经M-SYFSF干预12周后，与模型组相比，模型+M-SYFSF组的血清肌酐（11.56±1.70 μmol/L）、24小时尿白蛋白（54.90±26.67 mg）和UACR（8.87±1.69 μg/μmol）均显著降低（p<0.05），但血糖水平（31.69±2.82 mmol/L）无明显变化（p>0.05），说明M-SYFSF的肾脏保护作用不依赖于降血糖效应。肾脏病理染色显示，模型组肾小球体积增大、毛细血管袢轻度扩张、系膜基质增多、肾间质大量炎症细胞浸润；M-SYFSF干预后肾小球体积缩小，肾间质炎症细胞浸润和系膜基质增生明显减轻。Masson染色和免疫组化结果显示，M-SYFSF组肾组织中I型胶原表达显著降低，α-SMA蛋白表达水平也较模型组显著下降（p<0.01），提示M-SYFSF能够改善肾小管间质纤维化。
体外实验结果显示，AGEs处理HK-2细胞后，p-JNK、p-p38MAPK和p-ERK的表达较对照组显著升高，证实AGEs可激活MAPK信号通路。经不同浓度M-SYFSF干预后，p-JNK、p-p38MAPK和p-ERK的蛋白表达水平均显著降低，且呈一定浓度依赖性趋势。同时，AGEs处理使HK-2细胞中IL-6、IL-1β和TNF-α的表达显著升高，而M-SYFSF干预可显著降低这三种炎症因子的表达水平（p<0.05或p<0.01）。这些结果表明M-SYFSF可能通过抑制MAPK信号通路的磷酸化激活来减轻AGEs诱导的肾小管上皮细胞炎症反应。
本研究首次系统地将网络药理学分析与体内外实验验证相结合，阐明了M-SYFSF治疗DN的多成分、多靶点协同作用机制。研究表明，M-SYFSF很可能通过抑制MAPK信号通路的激活来降低炎症反应，从而减少尿蛋白排泄、改善肾脏病理损伤、延缓DN的进展。其中槲皮素、毛蕊异黄酮和芒柄花素被鉴定为M-SYFSF发挥治疗作用的核心活性化合物。
该研究的科学价值在于：一方面，通过网络药理学手段从系统层面揭示了中药复方“多成分-多靶点-多通路”的作用网络特征，为理解中药复方的整体调控机制提供了方法论示范；另一方面，通过体内外实验对网络药理学预测结果进行了实证验证，增强了研究结论的可靠性。在应用价值方面，本研究为M-SYFSF在DN临床治疗中的应用提供了理论依据和实验证据支持，也为进一步开展基于核心活性成分的药物研发和机制深化研究奠定了基础。
本研究的主要亮点包括：第一，方法学上采用了“网络药理学预测—分子对接验证—体内实验确证—体外实验机制解析”的整合研究策略，形成了从系统预测到实验验证的完整证据链；第二，研究聚焦于肾小管上皮细胞这一DN治疗的关键靶点，而非常规的肾小球损伤，拓展了对M-SYFSF作用部位的认识；第三，明确了M-SYFSF的肾脏保护作用独立于降血糖效应，这一发现对临床联合用药方案的制定具有参考意义；第四，通过UHPLC-MS/MS技术从复方中实际鉴定出核心活性化合物，而非仅依赖数据库预测，提高了成分鉴定的可信度。