本研究的第一作者为徐聪（Cong Xu），共同作者包括李益明（Yi-Ming Li）、孙博（Bo Sun）、钟芳静（Fang-Jing Zhong）以及通讯作者杨连粤（Lian-Yue Yang）。作者单位主要来自中国湖南省长沙市的中南大学湘雅医院肝脏外科及肝脏肿瘤实验室（Liver Cancer Laboratory, Xiangya Hospital, Central South University）。该研究成果发表在学术期刊《分子癌症研究》（Molecular Cancer Research）上，于2021年9月正式刊出（Volume 19, Issue 9）。

这项研究属于肿瘤学与分子生物学交叉领域，具体聚焦于肝细胞癌的发病机制与潜在治疗靶点。肝细胞癌是全球范围内高发且致死率高的恶性肿瘤。尽管近年来治疗手段有所发展，但患者的预后改善仍不理想，肿瘤的高复发与转移率是导致死亡的主要原因。因此，深入理解肝癌生长和转移的分子机制，对于开发有效的治疗靶点至关重要。研究团队将目光投向了一种名为精氨酰转移酶1（Arginyltransferase 1, ATE1）的蛋白质修饰酶。ATE1介导的蛋白质精氨酰化是一种重要的翻译后修饰，已知其在心血管发育、血管生成、脂肪生成、肌肉收缩等多种生物学功能中起关键作用。先前研究提示ATE1在多种人类癌症中可能扮演抑制角色并与不良预后相关，然而，其在肝细胞癌中的具体功能、分子机制及临床意义尚不明确。因此，本研究旨在系统探究ATE1在肝细胞癌发生发展中的作用，揭示其作用的分子通路，并评估其作为肝癌预后生物标志物的潜力。

本研究采用了多层次、系统性的研究流程，从临床样本分析到细胞、动物模型实验，再到深入的机制探索，主要包含以下五个紧密相连的研究步骤。首先，研究者进行了临床相关性分析。他们收集了两个独立队列的肝细胞癌患者样本，共200例（训练队列120例，验证队列80例），这些样本均来自中南大学湘雅医院系统。利用定量实时聚合酶链式反应、蛋白质印迹法和免疫组织化学技术，研究者检测了肝癌组织与配对癌旁正常肝组织中ATE1的表达水平。统计分析用于评估ATE1表达与患者临床病理特征（如肿瘤大小、结节数量、血管侵犯、TNM分期等）以及总生存期和无病生存期的相关性。其次，基于临床发现，研究者在体外细胞水平验证ATE1的功能。他们选用了ATE1表达水平不同的多株人肝癌细胞系，包括HepG2、Huh7（高表达）以及HCClM3、Hep3B（低表达）。通过慢病毒转染技术，在高表达细胞系中敲低ATE1，在低表达细胞系中过表达ATE1，构建了稳定的基因干预细胞模型。随后，运用MTT法、克隆形成实验检测细胞增殖能力；流式细胞术分析细胞周期分布；划痕愈合实验和Transwell侵袭实验评估细胞迁移和侵袭能力。第三，为了在更接近生理环境的模型中验证ATE1的功能，研究者建立了体内动物模型。他们将稳定转染的肝癌细胞（如HepG2-shATE1与对照细胞）皮下注射到裸鼠体内，构建皮下移植瘤模型，定期测量肿瘤体积和重量。更进一步，他们将皮下瘤组织块移植到裸鼠肝脏中，建立原位移植瘤模型，模拟肝癌在肝脏中的生长和转移。实验结束后，取肝、肺组织进行病理学检查，分析肿瘤的原位生长、肝内转移和肺转移情况。第四，研究转向分子机制探索。为了找到ATE1发挥作用的信号通路，研究者使用了Cignal Finder癌症10通路报告基因阵列进行初步筛选，发现Wnt/β-连环蛋白信号通路活性受ATE1调控。随后，通过免疫荧光、蛋白质印迹、免疫共沉淀和环己酰亚胺追踪实验，详细研究了ATE1对β-连环蛋白稳定性、泛素化水平和半衰期的影响。第五，机制深入研究。由于ATE1不直接作用于β-连环蛋白，研究者推测存在关键中间分子。基于ATE1通过N端规则通路降解含有特定N端基序的蛋白质这一已知机制，他们将目标锁定在ATE1的已知底物——G蛋白信号调节因子RGS4、RGS5和RGS16上。通过免疫组织化学相关性分析，他们发现只有RGS5的表达与β-连环蛋白水平呈显著正相关。接着，在已干预ATE1的细胞中进一步敲低或过表达RGS5，观察其对β-连环蛋白水平、Wnt通路活性以及细胞功能表型（增殖、迁移、侵袭）的影响。最后，为了阐明RGS5调控β-连环蛋白降解的具体环节，研究者检测了β-连环蛋白降解复合体（由APC、Axin、GSK3β、CK1等组成）关键成分的变化，特别是GSK3β的酪氨酸216位点磷酸化水平。他们还使用了GSK3抑制剂CHIR99021进行干预实验，以确认ATE1-RGS5轴与GSK3β活性之间的调控关系。

研究取得了系统且相互印证的结果。在临床层面，结果表明ATE1在肝癌组织中的mRNA和蛋白表达水平均显著低于配对的癌旁正常肝组织。免疫组化分析进一步证实了这一点。重要的是，ATE1低表达与更具侵袭性的临床病理特征显著相关，包括更大的肿瘤尺寸、多发结节、微血管侵犯和更晚期的TNM分期。生存分析显示，ATE1低表达的患者总生存期和无病生存期均显著短于ATE1高表达的患者。多变量分析确认ATE1低表达是肝癌患者术后生存的独立不良预后因素，这一结论在两个独立队列中均得到验证。在体外功能实验中，敲低ATE1显著促进了肝癌细胞（HepG2， Huh7）的增殖、克隆形成能力，并驱使更多细胞进入S期和G2/M期，同时增强了细胞的迁移和侵袭能力。相反，过表达ATE1则抑制了低表达细胞系（HCClM3， Hep3B）的上述恶性表型。这些结果直接证明了ATE1在体外具有抑制肝癌细胞生长和转移的作用。体内动物实验的结果与体外结果高度一致。ATE1敲低组的皮下瘤和原位瘤生长更快、体积和重量更大；而过表达ATE1则抑制了肿瘤生长。病理学分析进一步显示，ATE1敲低组的原位瘤表现出更高的细胞密度、更明显的核异型性，并且肝内转移和肺转移的发生率及转移灶数量均显著增加，表明ATE1抑制与肝癌的更低恶性潜能相关。在分子机制方面，通路筛选结果确认ATE1负向调控Wnt/β-连环蛋白信号通路。机制实验揭示，ATE1并不影响β-连环蛋白的转录，而是通过促进其泛素化-蛋白酶体途径的降解来降低其蛋白稳定性，缩短其半衰期。关键的中介分子被确定为RGS5。当在ATE1敲低的细胞中再次敲低RGS5，可以逆转β-连环蛋白的积累和Wnt通路的异常激活；反之，在ATE1过表达的细胞中再过表达RGS5，则能恢复β-连环蛋白的水平。功能回复实验也证实，RGS5的干预可以逆转ATE1对细胞增殖、迁移和侵袭的影响，确立了RGS5是ATE1发挥抑癌功能的关键下游效应分子。进一步的机制挖掘发现，RGS5通过影响GSK3β的酪氨酸216位点磷酸化水平来发挥作用。ATE1敲低或RGS5过表达会导致p-GSK3β (Y216)水平下降，进而减少β-连环蛋白N端（Ser33/37/Thr41）的磷酸化（这是其被泛素化降解的标志），最终稳定β-连环蛋白并激活Wnt通路。使用GSK3抑制剂CHIR99021可以模拟ATE1敲低或RGS5过表达的效果，协同促进Wnt信号，而过表达ATE1或敲低RGS5并不能完全抵消抑制剂的作用，表明ATE1-RGS5轴位于GSK3的上游并调控其活性。

本研究得出的核心结论是：精氨酰转移酶ATE1在肝细胞癌中是一个重要的肿瘤抑制因子。它通过促进其下游靶蛋白RGS5的降解（可能通过精氨酰化依赖的N端规则途径），解除RGS5对GSK3β活性的抑制，从而增强GSK3β介导的β-连环蛋白磷酸化与降解，最终抑制Wnt/β-连环蛋白信号通路的异常激活，达到抑制肝癌细胞增殖、迁移、侵袭和体内成瘤及转移的效果。此外，ATE1在肝癌组织中的低表达与患者不良预后密切相关，提示其可作为肝细胞癌一个潜在且有价值的预后生物标志物。

本研究具有多个重要亮点和创新之处。首先，在科学发现上，这是首次系统阐明ATE1在肝细胞癌中的肿瘤抑制功能及其完整的分子机制（ATE1→RGS5降解→p-GSK3β (Y216) ↑→β-连环蛋白降解↑→Wnt通路抑制→肝癌进展抑制），填补了该领域的研究空白。研究首次将ATE1-RGS5轴与经典的Wnt/β-连环蛋白信号通路及GSK3β磷酸化调控联系起来，构建了一个新的调控网络。其次，在研究策略上，工作非常系统和严谨，遵循了从临床现象（表达与预后关联）到体外体内功能验证，再到上下游分子机制深入剖析的经典转化研究范式，并使用了两个独立的临床队列进行验证，增强了结论的可靠性。实验设计环环相扣，特别是利用回复实验（Rescue experiment）在ATE1干预的基础上再干预RGS5，强有力地证明了RGS5是ATE1的关键效应分子。第三，在应用价值上，研究不仅揭示了新的生物学机制，还明确提出了ATE1作为肝癌预后评估指标的潜在临床应用价值，为未来开发基于ATE1的预后预测模型或靶向干预策略提供了理论依据。

其他有价值的内容包括研究对ATE1生物学功能的拓展，虽然已知其在多种生理过程中有重要作用，但本研究为其在肿瘤抑制，特别是实体瘤（肝癌）中的作用提供了坚实证据。此外，研究过程中建立稳定的基因干预细胞系、运用多种体内外肿瘤模型（皮下、原位、转移评估）以及综合运用分子生物学、细胞生物学和病理学技术，也为同类研究提供了良好的方法学参考。研究者也对可能存在的争议（如与其他癌症类型研究结果的差异）进行了探讨，将其归因于肿瘤类型的特异性（如肝癌持续缺氧的微环境），体现了科学思维的全面性。