一份关于ADORA1在鼻咽癌中作用机制的重要研究报告
研究团队与发表信息
本研究由Suming Pan, Sixian Liang, Xianyan Wang共同完成，他们均来自中国广东省韶关市的粤北人民医院（Department of Radiation Oncology, Yue Bei People’s Hospital, Shaoguan, Guangdong, China）。这项原创性研究成果以题为《ADORA1 promotes nasopharyngeal carcinoma cell progression through regulation of PI3K/AKT/GSK-3β/β-catenin signaling》的论文形式，发表于国际学术期刊《Life Sciences》上，该文章于2021年5月4日在线发表，最终收录于该刊第278卷。
学术研究背景与目的
本研究的科学领域聚焦于肿瘤学，特别是鼻咽癌（Nasopharyngeal Carcinoma, NPC）的分子发病机制。鼻咽癌在东南亚及中国南方地区高发，是头颈部常见的恶性肿瘤之一。尽管以放射治疗和化疗为主的综合治疗已取得进步，但肿瘤的远处转移仍然是治疗失败的主要原因，导致患者预后不佳。因此，深入探索NPC发生发展的分子机制，寻找新的预后标志物和治疗靶点具有重要的临床意义。
腺苷A1受体（Adenosine A1 Receptor, ADORA1）是一种细胞膜受体，其配体腺苷在肿瘤微环境中积累，被认为能够通过结合其受体促进肿瘤进展。尽管ADORA1在其他一些癌症中被发现具有促癌特性，但它在NPC中的表达模式、临床意义和生物学功能在很大程度上是未知的。基于此背景，本研究设定了明确目标：1）探究ADORA1在NPC组织和细胞系中的表达水平及其与临床病理特征、患者预后的关联；2）在体外和体内模型中，系统地阐明ADORA1对NPC细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭等恶性生物学行为的影响；3）揭示ADORA1发挥上述功能的潜在分子信号通路。
详细研究流程与方法
本研究设计严谨，包含多个相互关联的实验流程，综合运用了临床样本分析、体外细胞实验和体内动物模型。
第一部分：临床样本分析（流程A） 研究首先从临床层面入手。研究对象为126例NPC患者的癌组织样本，以及22例非癌性鼻咽炎活检组织作为对照。使用免疫组织化学染色（Immunohistochemistry, IHC）检测这些石蜡包埋切片中ADORA1蛋白的表达水平，并由两位病理学家进行半定量评分。评分基于染色强度和阳性细胞百分比，最终将样本分为ADORA1低表达和高表达组。同时，研究收集了配对的NPC癌组织和癌旁正常组织，采用蛋白质印迹法（Western blotting）和实时荧光定量PCR（Real-time PCR）分别检测ADORA1蛋白和mRNA的表达量。此外，研究团队还收集了患者的临床病理资料，通过卡方检验分析ADORA1表达水平与各项临床参数（如性别、年龄、TNM分期等）的相关性，并运用单因素及多因素Cox回归模型评估ADORA1作为预后因子的独立性。
第二部分：体外细胞功能实验（流程B） 为了探究ADORA1的功能，研究转向体外细胞模型。研究对象包括正常鼻咽上皮细胞NP69以及多个NPC细胞系（5-8F, HK1, SUNE1, HONE1, CNE-1, CNE-2）。首先，通过Real-time PCR检测了这些细胞系中ADORA1的内源性mRNA表达水平。随后，选择CNE-2和SUNE1两个细胞系进行功能增益和功能缺失实验。 1. 细胞模型构建：通过脂质体转染技术，向CNE-2和SUNE1细胞中分别导入过表达ADORA1的质粒（pCMV6-ADORA1）或特异性靶向ADORA1的小发夹RNA（shADORA1），同时设置空载体（EV）和乱序对照shRNA（shCon）作为对照。通过Western blotting验证转染效率。 2. 细胞增殖与克隆形成能力检测：使用MTT比色法连续5天检测细胞活力，评估ADORA1对细胞增殖的影响。克隆形成实验则评估了细胞的长期增殖和单克隆形成能力，细胞转染后培养两周，用吉姆萨染色并计数大于50个细胞的克隆。 3. 细胞凋亡检测：研究使用肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）处理细胞以诱导凋亡。通过Western blotting检测凋亡关键执行蛋白裂解的PARP（Cleaved PARP）和裂解的Caspase-3（Cleaved Caspase-3）的表达水平，来评估ADORA1过表达或敲低对细胞凋亡敏感性的影响。 4. 细胞迁移与侵袭能力检测：划痕愈合实验用于评估细胞的水平迁移能力：在细胞单层上划出一道划痕，于显微镜下观察并记录0小时和24小时后划痕闭合的面积。Transwell小室侵袭实验则用于评估细胞的侵袭能力：将细胞接种于铺有基质胶（Matrigel）的Transwell上室，下室为含血清的培养基作为趋化源，24小时后固定并染色下室的细胞，计数穿膜的细胞数。 5. 上皮-间质转化（Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT）相关蛋白检测：为了探究ADORA1促进迁移侵袭的可能机制，研究通过Western blotting检测了一系列EMT标志蛋白的表达，包括上皮标志物E-钙粘蛋白（E-cadherin）、间质标志物N-钙粘蛋白（N-cadherin）和波形蛋白（Vimentin），以及关键的EMT转录因子Snail。
第三部分：体内动物实验（流程C） 为了在更接近生理环境的条件下验证ADORA1的功能，研究建立了裸鼠异种移植瘤模型。 1. 过表达实验：将稳定过表达ADORA1的SUNE1细胞（SUNE1-ADORA1）和对照细胞（SUNE1-EV）分别皮下注射到雌性BALB/c裸鼠的背部两侧（每组n=6）。每两天测量一次肿瘤体积。 2. 敲低实验：将稳定敲低ADORA1的CNE-2细胞（CNE-2-shADORA1）和对照细胞（CNE-2-shCon）同样进行皮下注射成瘤。 实验持续19天后，处死小鼠，剥离并称量肿瘤。取出的肿瘤组织一部分用于提取蛋白进行Western blotting分析，另一部分经福尔马林固定、石蜡包埋后切片，用于后续Ki-67免疫组化染色（检测肿瘤细胞增殖活性）和TUNEL染色（检测肿瘤细胞凋亡情况）。
第四部分：分子机制探索（流程D） 这是研究的核心部分，旨在阐明ADORA1发挥作用的信号通路。 1. 关键信号通路初筛：在ADORA1过表达或敲低的细胞中，通过Western blotting检测了多条已知的肿瘤相关信号通路中关键蛋白的磷酸化状态，包括PI3K/AKT、mTOR等。 2. 通路抑制剂验证：发现ADORA1能显著激活PI3K/AKT通路后，研究使用该通路的特异性抑制剂LY294002进行处理。在ADORA1过表达的细胞中加入LY294002，通过Western blotting检测其对AKT磷酸化以及上述EMT标志蛋白表达的影响，以验证ADORA1的功能是否依赖于PI3K/AKT通路的激活。 3. 下游Wnt/β-catenin通路探究：AKT的激活可以磷酸化并抑制糖原合成酶激酶3β（Glycogen Synthase Kinase-3β, GSK-3β），从而导致β-catenin的稳定和核转位，激活经典的Wnt信号通路。因此，研究进一步检测了ADORA1对GSK-3β磷酸化（Ser9位点，抑制性磷酸化）的影响。通过核质分离技术和Western blotting，分析了β-catenin在细胞核内的积累情况。同时，使用TOP-Flash荧光素酶报告基因实验来定量检测ADORA1过表达或敲低后，细胞内β-catenin/TCF转录复合物的活性变化。 4. 通路关键节点功能回补实验：为了确认β-catenin在ADORA1功能中的必要性，研究在ADORA1过表达的细胞中，共转染针对β-catenin的小干扰RNA（siβ-catenin），然后再次检测细胞的侵袭能力（Transwell实验）和增殖能力（MTT实验），观察阻断β-catenin是否能逆转ADORA1的促癌效应。
主要研究结果
流程A结果：临床样本分析表明，ADORA1在NPC组织中的蛋白和mRNA水平均显著高于癌旁正常组织或非癌性对照组织。IHC染色显示NPC组织呈强阳性，而正常组织呈弱阳性或阴性。统计分析显示，ADORA1的高表达与更晚期的TNM分期显著相关，并且是预测NPC患者不良预后的独立危险因素。这初步确立了ADORA1在NPC中的潜在致癌作用和临床相关性。
流程B结果：体外功能实验获得了一系列支持性数据。首先，多个NPC细胞系的ADORA1 mRNA水平均高于正常鼻咽上皮细胞NP69。功能上，ADORA1过表达显著增强了CNE-2和SUNE1细胞的增殖活力、克隆形成能力、迁移速度和侵袭能力；同时，它抑制了细胞凋亡，表现为在TRAIL处理后，凋亡标志蛋白Cleaved PARP和Cleaved Caspase-3的表达降低。相反，敲低ADORA1则产生了完全相反的效应：抑制增殖、迁移和侵袭，并促进凋亡。机制上，ADORA1过表达诱导了EMT表型，即下调E-cadherin，上调N-cadherin、Vimentin和转录因子Snail；而敲低ADORA1则逆转了这一过程。这些结果在细胞水平上确证了ADORA1是一个促进NPC恶性进展的因子，并初步将其与EMT进程联系起来。
流程C结果：体内动物实验结果与体外发现高度一致。过表达ADORA1的肿瘤生长更快、最终体积和重量更大，其肿瘤组织Ki-67阳性率（增殖指数）更高。敲低ADORA1的肿瘤则生长受到显著抑制，瘤体更小更轻，且肿瘤组织中Ki-67阳性率降低，TUNEL阳性（凋亡）细胞增多。体内实验强有力地证明了ADORA1在活体环境中同样能促进肿瘤生长，其作用涉及促进增殖和抑制凋亡。
流程D结果：分子机制探索揭示了ADORA1作用的信号轴。Western blotting结果显示，ADORA1过表达显著上调了磷酸化AKT（p-AKT）的水平，而敲低ADORA1则降低其水平。使用PI3K/AKT抑制剂LY294002处理后，ADORA1过表达所诱导的AKT磷酸化增强被阻断，同时，ADORA1对EMT标志蛋白（E-cadherin, N-cadherin, Vimentin, Snail）的调控作用也几乎被完全消除。这表明ADORA1的功能严重依赖于PI3K/AKT通路的激活。进一步研究发现，ADORA1能增加抑制性磷酸化的GSK-3β（p-GSK-3β， Ser9）水平，促进β-catenin在细胞核内积累，并显著增强TOP-Flash报告基因的活性，即激活了Wnt/β-catenin信号。LY294002同样可以抑制ADORA1引起的GSK-3β磷酸化和β-catenin核转位。最后，功能回补实验证明，当用siRNA敲低β-catenin后，ADORA1过表达所促进的细胞侵袭和增殖效应被显著削弱。这些结果构成了一个完整的信号传导链条：ADORA1 → PI3K/AKT激活 → GSK-3β磷酸化（抑制）→ β-catenin稳定与核转位 → Wnt靶基因（如Snail）转录激活 → EMT及肿瘤细胞恶性表现。
研究结论与意义
本研究得出明确结论：ADORA1在鼻咽癌中是一个重要的致癌蛋白，它通过激活PI3K/AKT/GSK-3β/β-catenin信号通路，促进NPC细胞的增殖、迁移、侵袭，抑制其凋亡，并诱导EMT进程，从而驱动肿瘤的进展。
这项研究的科学价值在于：首次系统性地阐明了ADORA1在NPC中的高表达状态、促癌功能及其详细的下游分子机制，填补了该领域的一项知识空白。它将ADORA1与一个在癌症中极为关键的PI3K/AKT通路及其下游的Wnt/β-catenin通路联系起来，为理解NPC的发病机制提供了新的分子视角。其应用价值更为直接：首先，ADORA1的高表达与不良预后相关，提示它可能作为一个有价值的预后生物标志物，用于评估NPC患者的风险分层。其次，更重要的是，ADORA1被鉴定为一个新的、有潜力的治疗靶点。针对ADORA1的抑制剂（如文中提到的DPCPX），或针对其下游PI3K/AKT通路的药物，可能为NPC患者，特别是那些对现有放化疗不敏感或复发的患者，提供新的治疗策略。
研究亮点
其他有价值内容
研究在讨论部分还对比了ADORA1在其他癌症（如乳腺癌、肾癌）中的研究，以及其家族成员ADORA2A、ADORA2B在肿瘤免疫中的作用，为读者提供了更广阔的学术背景。同时，作者也坦诚指出了研究的局限性，例如ADORA1具体是如何激活PI3K/AKT通路的（上游机制）尚不完全清楚，这为后续研究指明了方向。文章最后强调，针对ADORA1及其通路进行干预，有望成为未来治疗NPC的有效策略。