本文是一篇综述文章，作者为Eduardo Ruiz-López和Alberto J. Schuhmacher，分别来自西班牙萨拉戈萨的Instituto de Investigación Sanitaria Aragón（IIS Aragón）分子肿瘤学组和Fundación Aragonesa para la Investigación y el Desarrollo（ARAID）。文章于2021年7月31日发表在期刊《Biomolecules》上，文章标题为“Transportation of Single-Domain Antibodies through the Blood–Brain Barrier”。本文系统综述了单域抗体（single-domain antibodies），包括纳米抗体（nanobodies）和VNARs穿越血脑屏障（blood–brain barrier, BBB）进入中枢神经系统（central nervous system, CNS）的多种策略和机制，并讨论了其在诊断、治疗和诊疗一体化（theragnosis）中的潜力与挑战。
文章首先介绍了血脑屏障的解剖结构和生理功能。BBB是由脑微血管内皮细胞（brain microvascular endothelial cells, BMECs）、周细胞、星形胶质细胞、小胶质细胞、神经元以及细胞外基质共同组成的神经血管单元（neurovascular unit）构成的。BMECs之间通过紧密连接和粘附连接形成高度限制性的屏障，使得除小分子脂溶性物质（分子量小于400 Da）外，绝大多数分子（约98%）无法通过被动扩散进入脑实质。BMECs还表达多种外排泵如P-糖蛋白（P-glycoprotein）和α(2,3)-唾液酸糖蛋白受体（alpha(2,3)-sialoglycoprotein receptor），主动阻止代谢废物和其他分子进入脑内。BBB在健康状态下对感染和毒性物质具有保护作用，但其功能受损或完整性破坏与多种神经系统疾病和脑病理状态相关，包括脑肿瘤、炎症和感染等，这种BBB渗漏（BBB leakiness）可能有利于单域抗体的脑内摄取。
文章比较了传统IgG抗体和单域抗体在穿越BBB方面的差异。传统IgG抗体因存在Fc段与Fc受体（FcγR和FcRn）的相互作用，脑摄取受到很大限制，脑内浓度仅为血浆浓度的0.01–0.4%。相比之下，纳米抗体和VNARs是源自骆驼科动物重链抗体和软骨鱼免疫球蛋白新抗原受体的最小功能性抗原结合片段，分子量仅12–15 kDa，直径2.5 nm，高度4 nm。纳米抗体具有较长的CDR1和CDR3区域，VNARs则具有类似的延伸CDR3但缺乏CDR2。这些结构特点赋予单域抗体高亲和力（纳摩尔至皮摩尔级别）、高溶解度、良好的化学和热稳定性以及识别独特构象表位的能力。然而，其快速肾清除（半衰期30–60分钟）和表面电荷的限制也为其脑内递送带来挑战。通过聚乙二醇化（PEGylation）、与Fc段融合或构建多价/多表位形式，可改善其药代动力学特性。
文章详述了单域抗体穿越BBB进入脑实质的多种机制和策略。第一，在BBB完整性受损的病理状态下，单域抗体可被动进入脑内。例如，靶向HER2的纳米抗体68Ga-NOTA-anti-HER2 VHH1已在临床试验中用于检测乳腺癌脑转移；靶向EGFR和EGFRvIII的纳米抗体在胶质瘤小鼠模型中成功实现肿瘤成像；靶向VCAM-1的纳米抗体在脑血管炎症模型中达到了较高的脑内浓度。
第二，通过物理化学方法或设备直接破坏或绕过BBB。对流增强递送（convection-enhanced delivery, CED）通过立体定向植入脑实质内的微导管直接持续灌注药物，可绕过BBB，但长期疗效评估仍具挑战性。高渗性药物甘露醇（mannitol）通过动脉内注射可瞬时打开BBB，增强纳米抗体的脑内滞留。此外，磁热疗可通过纳米颗粒的磁场激发产生局部高温（40–43 °C），可逆性打开BBB，从而增加药物入脑。
第三，受体介导的转胞吞作用（receptor-mediated transcytosis, RMT）是单域抗体穿越完整BBB的重要机制。第一个被报道通过RMT穿越BBB的纳米抗体是FC5和FC44，其中FC5可结合BMECs上的α(2,3)-唾液酸糖蛋白受体并诱导网格蛋白（clathrin）包被囊泡形成，依赖肌动蛋白和磷酸肌醇3-激酶（PI3K）进行转胞吞。FC5和FC44在体内脑脊液/血浆比率比对照纳米抗体提高了20至40倍，并已被用作分子穿梭载体，将 BBB 通透性差的多肽如达拉根（dalargin）递送入脑。其他靶向IGF1R、VCAM-1、朊蛋白（PrP）和转铁蛋白受体-1（TfR1）的纳米抗体也被证实可通过RMT进入脑内。其中，VNAR TxB2是唯一被报道通过RMT穿越BBB的II型VNAR，其与TfR1结合，且融合到Fc段后可将脑内水平提高13至21倍。
第四，吸附介导的转胞吞作用（adsorptive-mediated transcytosis, AMT）依赖于阳离子分子与BMECs膜上阴离子微区之间的静电相互作用。具有高等电点（isoelectric point, pI约为9.5）的纳米抗体可自发穿越BBB。例如，靶向GFAP的纳米抗体mvhh E9（pI=9.4）及其与EGFP的融合蛋白能够特异性地标记脑内星形胶质细胞；具有碱性pI的抗Aβ纳米抗体R3VQ和抗磷酸化tau纳米抗体A2能够识别阿尔茨海默病小鼠模型中的淀粉样沉积和神经原纤维缠结，而中性pI的R3VE则脑内渗透有限。
第五，通过穿梭载体介导的转胞吞作用（shuttle-mediated transcytosis）递送单域抗体。细胞穿透肽（cell-penetrating peptides, CPPs）如penetratin已被用于将靶向病理形式朊蛋白或α-突触核蛋白寡聚体的单链抗体（scFv）递送入脑，但CPP与纳米抗体融合穿越BBB的研究仍有限。脂质体（liposomes）经过靶向修饰后可用于递送纳米抗体。例如，谷胱甘肽修饰的PEG脂质体包裹靶向Aβ的纳米抗体pa2H后改善了其在阿尔茨海默病小鼠模型中的脑内分布和淀粉样斑块滞留。纳米颗粒（nanoparticles）作为多价递送平台可提高纳米抗体的脑内穿透性，碳纳米管与纳米抗体偶联后可在斑马鱼模型中治疗病毒性中枢神经系统疾病，抗IGFBP7纳米抗体偶联的Fe3O4纳米颗粒在胶质瘤模型中表现出更高的靶向效率。
第六，通过体细胞基因转移（somatic gene transfer）在脑内长期产生纳米抗体。利用腺相关病毒（adeno-associated virus, AAV）载体递送靶向BACE1的纳米抗体VHH-B9可在阿尔茨海默病小鼠模型中长期抑制Aβ产生。新一代重组AAV载体通过衣壳工程改造并结合BBB穿梭肽，可在静脉注射后高效穿越BBB并广泛转导CNS细胞，为系统递送编码纳米抗体的基因提供了可能。
文章最后讨论了未来的发展方向。BBB在胚胎和新生儿时期尚未成熟，血管渗漏可能有利于纳米抗体的脑内摄取，但相关研究仍不充分。RMP-7（一种缓激肽激动剂）和regadenoson（腺苷A2A受体激动剂）等药物可通过瞬时调节BBB通透性来辅助纳米抗体入脑。超声结合微泡（microbubbles）技术可暂时打开BBB，纳米抗体修饰的微泡有望实现超声分子成像和药物递送。此外，细胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs），尤其是外泌体（exosomes），因其低免疫原性和天然跨越BBB的能力，在纳米抗体递送方面显示出独特优势。CAR-T细胞分泌纳米抗体的策略也为CNS疾病治疗提供了新的思路。血-脑脊液屏障（blood–CSF barrier）和脑内淋巴系统也可能作为纳米抗体进入CNS的替代途径。
本文全面梳理了单域抗体穿越血脑屏障的机制和方法，强调了BBB对CNS药物开发的限制以及纳米抗体在这一领域的独特优势。通过受体介导、吸附介导、穿梭载体、物理化学破坏和基因转移等多策略结合，单域抗体有望在脑肿瘤、神经退行性疾病和中枢神经系统感染的诊断与治疗中发挥重要作用。首个获批的纳米抗体药物caplacizumab（ALX-0681）的临床应用为单域抗体的发展注入了重要信心，而跨越BBB进入脑实质仍是当前研究的关键目标。