本研究由西南大学的张园园、赵金文、杨国敏、何颖、陈世宏（通讯作者，邮箱：cshong@swu.edu.cn）和袁若共同完成，研究成果以题为《基于“dd-a”FRET二元探针和四价十字形DNA纳米结构介导的级联放大对淀粉样β寡聚体的超灵敏检测》（Ultrasensitive Detection of Amyloid β Oligomers Based on the “dd−a” FRET Binary Probes and Quadrivalent Cruciform DNA Nanostructure-Mediated Cascaded Amplifier）的论文形式，于2021年7月2日在线发表在学术期刊《ACS Applied Materials & Interfaces》上（2021年第13卷，第32013-32021页）。

这项研究属于分析化学与生物传感器交叉领域，特别聚焦于针对阿尔茨海默病（Alzheimer‘s Disease， AD）早期诊断标志物——淀粉样β蛋白寡聚体（Amyloid β Oligomer Species， AβOs）的超灵敏检测技术开发。研究的学术背景源于几个关键的科学需求与挑战。首先，阿尔茨海默病作为一种严重的神经退行性疾病，其早期诊断至关重要。研究表明，可溶性的AβOs是脑脊液中最具神经毒性的形式，并在疾病临床症状出现前10-15年就开始积累，因此被视为AD早期诊断的特异性生物标志物之一。然而，AβOs在生物样本中含量极低（痕量水平），这对检测技术的灵敏度提出了极高要求。其次，荧光共振能量转移（Fluorescence Resonance Energy Transfer， FRET）技术因其设计简单、耗时短、操作简便，并能通过记录两个荧光发射的强度比来有效消除系统波动和环境影响，已成为检测多种生物分子的成熟方法。其中，供体-供体-受体（”Donor Donor-Acceptor“， ”dd-a“）FRET模式通过让两个相邻的荧光供体（本研究中使用FAM）与一个荧光受体（本研究中使用TAMRA）相互靠近，能显著提高FRET效率，从而提升检测灵敏度。然而，以往报道的”dd-a“ FRET系统通常依赖于DNA分子在溶液中的随机碰撞和相互作用，存在生物稳定性弱、反应动力学慢、杂交效率低等固有缺陷。最后，DNA纳米结构（如DNA折纸、DNA四面体等）因其优异的生物相容性、纳米尺度可控性和空间寻址能力，被证明是增强生物稳定性和反应动力学的理想平台，但在”dd-a“ FRET模式与高效DNA纳米结构介导的催化发夹组装（Catalyzed Hairpin Assembly， CHA）放大器结合方面，尚未有报道。因此，本研究旨在克服现有”dd-a“ FRET系统的不足，开发一种新型的、高效的DNA纳米结构介导的级联信号放大策略，以实现对痕量AβOs的超灵敏、高特异性检测。

本研究的工作流程设计精巧且环环相扣，主要包括以下几个关键步骤和程序：

第一步：关键组分的制备与表征。 这是整个传感平台构建的基础。研究首先合成了所有必要的DNA寡核苷酸序列（序列信息见附表S1），包括用于构建四价十字形DNA纳米结构（Quadrivalent Cruciform DNA Nanostructure， QCDN）的Y1、Y2、Y3、Y4四条链，标记有两个FAM荧光团作为供体的发夹探针H1，标记有一个TAMRA荧光团作为受体的发夹探针H2，以及用于目标循环（Target Recycling）的适体发夹探针（Hairpin Aptamer Probe， HAP）、发夹P1和链C。AβOs则通过将Aβ单体（Aβ1-40）在特定条件下孵育制备。核心的纳米结构组装过程如下：将Y1-Y4四条链退火，通过碱基互补配对自组装形成QCDN。随后，利用QCDN四个末端（A9C6序列）与H1或H2末端（T9G6序列）的互补配对，分别将四个H1或四个H2发夹探针精确组装到单个QCDN上，从而构建出两种功能化的纳米结构：QCDN-H1和QCDN-H2。这种设计确保了四个发夹探针在空间上彼此分离，有效避免了密集DNA纳米结构可能带来的高位阻效应。同时，发夹P1与链C杂交形成P1-C复合物。研究通过天然聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native PAGE）对QCDN、QCDN-H1和QCDN-H2的成功组装进行了验证（图1b），结果显示随着DNA链的逐步加入，电泳条带迁移率逐步降低，确认了预期结构的形成。

第二步：检测流程的执行与信号产生。 这是传感机制的核心操作阶段。整个检测在一个混合溶液体系中顺序进行。首先，将不同浓度的目标物AβOs与HAP在37°C下孵育120分钟。AβOs与HAP中的适体片段特异性结合，导致HAP的构象发生变化，暴露出新的序列。接着，将预先制备好的P1-C复合物、QCDN-H1和QCDN-H2加入上述混合溶液中，在35°C下进一步杂交120分钟。在此过程中，暴露的HAP序列与P1-C中的黑色区域杂交，并通过分支迁移（Branch Migration）打开P1-C复合物，同时释放出目标AβOs和链C。释放出的AβOs可以循环使用，继续与新的HAP结合，从而释放出更多的链C，实现目标循环放大，产生大量的链C。随后，释放的链C作为催化剂，触发QCDN介导的级联催化发夹组装（Cascaded CHA）反应：链C首先通过 toehold介导的链置换反应与QCDN-H1杂交，形成C-QCDN-H1中间体；接着，QCDN-H2的 toehold与该中间体新暴露的片段杂交，并通过链迁移置换出链C，同时形成稳定的QCDN-H1-QCDN-H2复合物。被置换出的链C可以继续作为催化剂，触发下一轮CHA反应，形成链式循环放大。最终，大量的QCDN-H1和QCDN-H2通过CHA反应交联，自组装形成一个层状的、多孔的DNA纳米网络（DNA nanonet）。在这个网络中，来自QCDN-H1的两个FAM供体与来自QCDN-H2的一个TAMRA受体在空间上被拉近，从而发生高效的“dd-a” FRET，导致FAM在520 nm处的荧光强度显著降低，而TAMRA在580 nm处的荧光强度显著增强。

第三步：信号读取与数据分析。 使用荧光光谱仪在496 nm激发波长下测量样品的荧光发射光谱，采集510至650 nm范围内的数据。通过计算受体TAMRA在580 nm处的荧光强度（Fa）与供体FAM在520 nm处的荧光强度（Fd）的比值（Fa/Fd，即FRET比率）来量化检测信号。这种比率型信号输出方式可以内置校正环境干扰，提高检测的可靠性和准确性。研究还通过原子力显微镜（AFM）对最终形成的DNA纳米网络结构进行了形貌表征（图2），直观地证实了多孔网状结构的成功构建。

本研究取得了多方面显著的结果，这些结果系统地验证了所提出策略的可行性、优越性和应用潜力。

验证策略可行性： 荧光光谱和多种表征技术共同证实了传感机制的有效运行。如图1a所示，在存在目标AβOs的情况下，520 nm处的FAM荧光强度急剧下降，而580 nm处的TAMRA荧光强度显著上升，产生了强烈的FRET信号，与空白对照形成鲜明对比。Native PAGE实验进一步提供了分子层面的证据：图1c验证了目标循环过程，在AβOs存在下，可以观察到代表游离链C的条带出现，表明AβOs成功触发了链C的释放。图1d则验证了CHA循环过程，当加入链C后，可以观察到代表H1-H2复合物或更大聚合结构的慢迁移条带，表明CHA反应被成功触发。AFM图像（图2a）清晰地展示了最终形成的多孔DNA纳米网络结构，其高度轮廓（图2b）与DNA双链的高度相符，为整个级联放大和自组装过程提供了直接的形貌学证据。所有这些结果连贯一致，逻辑清晰地证明了从目标识别、循环放大、级联CHA到最终FRET信号产生的完整通路是可行的。

优化实验条件： 为了获得最佳检测性能，研究对关键实验参数进行了系统优化（图3）。结果表明：适体发夹探针HAP的最佳浓度为500 nM；Aβ单体形成AβOs的最佳孵育时间为25小时；QCDN-H1中H1与QCDN-H2中H2的最佳浓度比为1:2，这与“dd-a”模式中供体与受体的理想比例相符；目标循环和CHA循环的最佳反应温度为35°C。这些优化条件为后续的高性能检测奠定了基础。

证明放大效率与性能优势： 这是本研究的核心亮点。研究通过构建三种对照探针与传统方法进行比较，充分证明了其策略的优越性（图4）。对照探针包括：（a）传统CHA（无QCDN，使用“d-a” FRET模式）、（b）CHA结合QCDN但使用“d-a” FRET模式、（c）CHA结合“dd-a” FRET模式但无QCDN。而本研究的目标探针（d）是CHA结合“dd-a” FRET模式且结合QCDN。结果表明：目标探针（d）产生的FRET信号最强，FRET比率（Fa/Fd）最高（图4a插图）。在不同浓度AβOs下，探针（d）的FRET比率响应也远高于其他对照（图4b）。计算得出的FRET效率显示，目标探针（d）的FRET效率高达约78%，是传统CHA（探针a）的2.3倍（图4c）。最重要的是动力学分析：目标探针（d）对100 nM AβOs的响应完成时间约为24分钟，比传统CHA快4.38倍；其初始反应速率更是传统CHA的25倍（图4d）。这些数据强有力地证明，QCDN介导的级联CHA放大器与“dd-a” FRET模式的结合，协同实现了反应动力学的极大加速、杂交效率和FRET效率的显著提升。

评估检测性能与实际应用： 在最优条件下，该生物传感平台对AβOs表现出优异的分析性能（图5）。随着AβOs浓度从1 pM增加到100 nM，FAM荧光持续减弱，TAMRA荧光持续增强（图5a）。FRET比率（Fa/Fd）与AβOs浓度的对数在1 pM至100 nM范围内呈现良好的线性关系，线性方程为 I = 0.5141 lg C_AβOs + 6.473，检测限（信噪比S/N=3）低至0.69 pM（图5b）。与文献中报道的其他AβOs检测方法相比（论文附表S2），该方法在灵敏度方面具有明显优势。特异性实验表明（图S1），即使在高浓度（100倍）的Aβ单体、Aβ纤维、癌胚抗原、甲胎蛋白和铁蛋白等干扰物存在下，该平台也只对AβOs及其混合物产生显著的荧光响应，表现出高度的特异性。在实际样本（人工脑脊液和50倍稀释的血清）中的加标回收实验结果显示（表1），回收率在93.3%至106.9%之间，相对标准偏差（RSD）较低，证明了该方法在复杂生物基质中检测AβOs的准确性与可靠性，具备实际应用的潜力。

本研究的结论是，成功设计并构建了一种整合了四价十字形DNA纳米结构（QCDN）介导的级联催化发夹组装（CHA）放大器与“供体-供体-受体”（“dd-a”）FRET二元探针的新型荧光生物传感平台，用于超灵敏检测阿尔茨海默病早期标志物淀粉样β蛋白寡聚体（AβOs）。该策略的意义与价值体现在多个层面：在科学价值上，它创新性地将空间可控的DNA纳米结构作为支架，用于固定和定向多个发夹探针，创造性地解决了传统溶液相“dd-a” FRET系统生物稳定性差、反应动力学慢的问题。通过QCDN实现的多反应方向协同、局部浓度提升以及碰撞概率增加，与高效的“dd-a” FRET信号模式相结合，为设计高性能的比率型荧光生物传感器提供了一个全新的、高效的范式。在应用价值上，所开发的平台实现了对痕量AβOs（pM级别）的超灵敏、高特异性检测，并且在实际样本中表现良好，为阿尔茨海默病的早期、无创或微创诊断（如通过脑脊液或血液检测）提供了一种极具前景的新方法，有助于推动AD的早期筛查和病情监测。

本研究的亮点突出，主要体现在以下几个方面：第一，重要的发现： 建立了FRET效率高达78%、初始反应速率比传统方法快25倍的超灵敏AβOs检测新体系，检测限达到0.69 pM的国际先进水平。第二，方法的新颖性： 这是首次报道将“dd-a” FRET模式与DNA纳米结构介导的级联CHA放大器相结合的策略。所设计的QCDN不仅作为探针载体，更通过其多价态和空间结构介导了高效的级联放大反应，并最终引导形成多孔DNA纳米网络，极大提升了传感性能。这种“结构引导功能”的设计思想具有很高的创新性。第三，研究对象的特殊性： 直接针对阿尔茨海默病早期诊断的关键和挑战性标志物——AβOs，研究成果具有明确的重大疾病诊疗应用导向和社会价值。第四，完善系统的验证： 研究不仅通过荧光信号和凝胶电泳验证了原理，还利用AFM直观展示了最终的自组装纳米结构，并通过严谨的对照实验和条件优化，全面、量化地证明了该策略相较于传统方法的各项性能优势，工作扎实，论证充分。

此外，论文中还包含了详细的实验部分（试剂、仪器、具体操作步骤）和丰富的支撑信息（DNA序列、与其他方法的性能对比表等），体现了研究的规范性和可重复性。作者也对国家自然科学基金和重庆市自然科学基金的资助表示了感谢。这项研究是DNA纳米技术、信号放大策略和荧光传感技术巧妙融合的一个成功范例，为解决生物标志物痕量检测的难题提供了创新思路和有效工具。