基于多价适配体纳米药物偶联物的铜死亡与谷胱甘肽耗竭协同肿瘤治疗策略的研究报告
主要作者及发表信息
本研究由上海交通大学医学院附属仁济医院分子医学研究院（Institute of Molecular Medicine, Renji Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University）的Yu Yang（杨宇）和Weihong Tan（谭蔚泓）团队主导完成，共同第一作者为Shuang Wang、Xueliang Liu和Dali Wei。该研究成果于2024年10月在《Journal of the American Chemical Society》（JACS）上在线发表，题为“Polyvalent Aptamer Nanodrug Conjugates Enable Efficient Tumor Cuproptosis Therapy through Copper Overload and Glutathione Depletion”。
研究背景与目的
本研究聚焦于肿瘤治疗领域一个新兴的概念——铜死亡（cuproptosis）。铜死亡是2022年被首次报道的一种依赖于线粒体铜过载的新型细胞程序性死亡方式。过量的亚铜离子（Cu⁺）在线粒体内与三羧酸循环（TCA cycle）中的硫辛酰化蛋白结合，导致硫辛酰化二氢硫辛酰胺S-乙酰转移酶（DLAT）寡聚化和铁-硫簇蛋白的下调，引发蛋白毒性应激，最终导致细胞死亡。铜死亡疗法具有高效和低耐药性的优点，但其临床应用受限于两大瓶颈：第一，肿瘤细胞内源性的铜离子浓度不足以有效启动铜死亡；第二，肿瘤微环境中高浓度的谷胱甘肽（glutathione, GSH）会螯合Cu⁺，阻碍了其与靶蛋白的相互作用，从而抑制铜死亡的发生。
为解决这一难题，研究团队提出了一种“开源节流”（“open-source cost-saving”）的创新协同治疗策略。该策略旨在同步实现两个目标：“开源”，即通过外源递送铜离子，增加线粒体铜过载；“节流”，即通过芬顿样反应（Fenton-like reaction）产生羟基自由基（·OH），高效耗竭胞内的谷胱甘肽，从而消除其对铜离子的螯合作用，增强肿瘤细胞对铜死亡的敏感性。为实现这一策略并解决铜离子潜在的全身毒性问题，研究人员设计并构建了一种结构新颖、具备肿瘤靶向递送能力的多价适配体纳米药物偶联物。
详细研究流程与方法
本研究的实验流程主要分为三个层次：纳米药物偶联物的设计合成与表征、体外细胞实验验证、以及体内动物实验评估。
1. 纳米药物偶联物（Cupes@pApt）的设计、合成与表征
该部分是整个研究的基础，旨在构建一个集铜死亡诱导剂高效负载与肿瘤主动靶向递送于一体的智能纳米平台。
首先，多价适配体长链（pApt）的合成：研究团队设计了一条模板DNA，其序列同时编码了上皮细胞粘附分子（EpCAM）的适配体和重复的polyT序列。EpCAM适配体负责特异性识别并结合肿瘤细胞表面高表达的EpCAM蛋白，而polyT序列则用于螯合铜离子。为了克服单链适配体亲和力低、稳定性差、载药量低等缺点，研究人员采用了滚环扩增技术（RCA）。他们先将模板DNA用T4连接酶环化，然后在Phi29 DNA聚合酶和dNTPs的作用下，扩增出包含大量重复EpCAM适配体和polyT序列的超长单链DNA，即多价适配体pApt。
其次，铜过氧化物-伊利司莫纳米点（Cupes纳米点）的合成：研究人员通过将铜离子（Cu²⁺）、过氧化氢（H₂O₂）和伊利司莫（elesclomol, ES）进行配位自组装，并原位包裹聚乙烯吡咯烷酮（PVP）以提高其水溶性和分散性，成功制备了Cupes纳米点。伊利司莫是一种铜离子载体，其功能是将铜离子特异性地转运到线粒体内。
最后，Cupes@pApt偶联物的组装与表征：将上述合成的Cupes纳米点与pApt共孵育，借助pApt长链上的polyT序列对铜离子的螯合作用，使Cupes纳米点装载到pApt链上。原子力显微镜（AFM）成像直观地显示，Cupes@pApt呈现出独特的“核小体样”（nucleosome-like）结构。动态光散射（DLS）测定显示其平均水合粒径约为40纳米，Zeta电位向负值方向移动，这些数据共同证实了偶联物的成功构建。稳定性实验表明，相比于单链适配体，多价的pApt和Cupes@pApt在核酸外切酶I和10%血清环境中展现出显著增强的稳定性，这对于其在生物体内的应用至关重要。此外，通过模拟不同pH环境，实验证实Cupes@pApt具有酸性环境响应性，其在生理pH（7.4）条件下保持稳定，而在酸性溶酶体环境（pH 3.5-5.5）下可有效分解释放Cu²⁺和H₂O₂，从而启动高效的芬顿样反应，并有效耗竭谷胱甘肽。
2. 体外细胞实验验证“开源节流”策略增敏铜死亡
该部分使用小鼠乳腺癌细胞系（4T1），系统验证了Cupes@pApt在细胞层面的作用效果。
靶向与内吞：通过荧光标记的适配体进行流式细胞术和共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察，结果显示，与单链适配体偶联物（Cupes@Apt）相比，Cupes@pApt对4T1细胞展现出更强的结合亲和力和更高效的内吞效率，这归功于多价效应。
谷胱甘肽耗竭与铜过载：Cupes@pApt被证实能够进入细胞的溶酶体。在溶酶体酸性环境下降解后，释放的Cu²⁺和H₂O₂引发芬顿样反应，生成大量羟基自由基。通过荧光探针DCFH-DA检测发现，处理组细胞内活性氧（ROS）水平显著升高。随后，使用谷胱甘肽检测试剂盒及荧光探针证实，Cupes@pApt能够最有效地耗竭细胞内的谷胱甘肽（降低78%），此即“节流”。同时，通过电感耦合等离子体发射光谱仪（ICP-OES）测定发现，Cupes@pApt处理组的细胞内总铜离子浓度高于其他对照组，实现“开源”。
铜死亡效果评价：研究团队进一步检测了铜死亡的关键标志物。CLSM成像和免疫印迹（Western blot）结果显示，Cupes@pApt处理组中，游离的硫辛酰化DLAT水平最低，同时FDX1和LIAS蛋白的表达也显著下调，这表明DLAT蛋白发生了大量的寡聚化，这是线粒体铜过载导致蛋白毒性应激和细胞发生铜死亡的直接证据。最终的细胞活力检测（CCK-8法）证实，Cupes@pApt对肿瘤细胞的杀伤效果在所有实验组中最强，验证了“开源节流”策略在体外高效增强肿瘤细胞铜死亡的可行性。
3. 体内动物实验评估抗肿瘤效果、靶向性及免疫响应
该部分在荷有4T1肿瘤的BALB/c小鼠模型上，分别通过瘤内和静脉注射两种方式，全面评估了Cupes@pApt的体内疗效。
瘤内注射实验：将小鼠随机分为5组（对照组、ES组、Cup组、Cupes组、Cupes@pApt组），进行瘤内注射治疗。结果显示，Cupes@pApt组的肿瘤生长抑制效果最为显著，且肿瘤质量最小。肿瘤切片的H&E染色显示出最广泛的肿瘤组织坏死。组织学染色进一步揭示，Cupes@pApt处理组的肿瘤组织中ROS水平最高，GSH水平最低，且游离的DLAT水平最低，在活体层面完美复现了体外实验的机制，即在肿瘤组织内实现了高效谷胱甘肽耗竭和强效铜死亡诱导。
静脉注射实验与体内分布：为评估其系统给药的潜力，研究人员通过尾静脉注射了ICG标记的Cupes@pApt。活体荧光成像显示，Cupes@pApt在肿瘤部位有显著的富集和长效的滞留，其富集量远高于无靶向的Cupes组和单链适配体靶向的Cupes@Apt组。药代动力学研究表明，Cupes@pApt具有较长的血液半衰期。在抗肿瘤实验中，静脉注射Cupes@pApt展现出最优异的疗效，能显著抑制肿瘤生长，且未观察到明显的体重下降或主要器官损伤，表明其具有良好的生物安全性。
抗肿瘤免疫响应研究：鉴于铜死亡能诱导免疫原性细胞死亡（ICD），研究团队深入分析了其引发的免疫应答。在Cupes@pApt处理后，肿瘤组织中钙网蛋白（CRT）的暴露水平显著升高，这是ICD发生的关键标志。对引流淋巴结的分析显示，树突状细胞（DCs）的成熟比例显著增加。更重要的是，在肿瘤浸润淋巴细胞的分析中，Cupes@pApt组中增殖性（ki67⁺）和效应性（IFN-γ⁺）的CD8⁺ T细胞比例均大幅提升。这表明，Cupes@pApt诱导的铜死亡能够有效触发抗肿瘤免疫反应，将“冷”肿瘤转变为“热”肿瘤，实现了化疗与免疫治疗的协同作用。
研究结论与意义
本研究成功开发了一种名为Cupes@pApt的新型多价适配体纳米药物偶联物，并提出了一种创新的“开源节流”协同治疗策略，以克服肿瘤细胞对铜死亡治疗敏感性低这一核心挑战。该工作通过多价适配体的靶向递送，实现了铜离子和药物的高效肿瘤富集，同步完成了线粒体铜过载和胞内谷胱甘肽耗竭，从而极大地增强了铜死亡治疗的效果。更重要的是，该疗法诱导的免疫原性细胞死亡能够有效激活宿主的抗肿瘤免疫应答，形成了一种“铜死亡-免疫协同”的治疗模式。
本研究的科学价值在于，它不仅为铜死亡疗法提供了一种全新的、系统性的解决方案，还深化了对铜死亡机制与免疫系统之间相互作用的理解。其应用价值则体现在，Cupes@pApt作为一个高效的靶向递送平台，展示出了优异的疗效和生物安全性，为未来的临床转化，特别是针对化疗耐药性肿瘤的治疗，提供了极具前景的途径。同时，该多价适配体偶联策略也为其他有毒金属离子药物的安全、精准递送提供了通用性平台设计思路。
研究亮点