关于IL-2Rα偏向性激动剂通过激活肿瘤浸润性CD25+CD8+ T细胞增强抗肿瘤免疫的研究报告
一、 研究作者、机构与发表信息 本项研究由来自中国苏州信达生物制药公司多个部门的科研人员共同完成。主要作者包括 Weiwei Wu, Tiongsun Chia, Jia Lu, Xue Li, Jian Guan, Yaning Li, Fenggen Fu, Shuaixiang Zhou, Ye Feng, Junjie Deng, Jia Zou, Jiya Sun, Ying Yao, Xiaomin Ling, Zhihai Wu, Ying Zhang, Jinling Xu, Feifei Wang, Xue Liang, Min Wu, Huisi Liu, Bingliang Chen 及 Kaijie He。研究于2023年9月发表于 Nature Cancer 期刊（第4卷，第1309–1325页）。
二、 学术背景与研究目的 本研究的科学领域是肿瘤免疫学与免疫治疗，聚焦于细胞因子白介素-2（Interleukin-2, IL-2）的临床应用优化。IL-2是一种具有双重功能的细胞因子：低剂量时，它通过高亲和力三聚体受体（IL-2Rαβγ）优先激活调节性T细胞（Regulatory T cells, Treg），产生免疫抑制；高剂量时，在饱和Treg受体后，过量的IL-2可通过中等亲和力的二聚体受体（IL-2Rβγ）激活效应T细胞（Teff）和自然杀伤细胞（NK），从而促进抗肿瘤免疫。首个FDA批准的IL-2疗法（Proleukin）虽然对部分黑色素瘤和肾细胞癌有效，但其严重副作用（尤其是血管渗漏综合征）限制了其广泛应用。
为提升治疗窗口，既往的研究策略主要集中于开发“βγ偏向性”（IL-2Rβγ-biased）的IL-2类似物，即通过破坏与IL-2Rα（CD25）的结合，旨在避免Treg激活和血管毒性。然而，近期临床研究（如bempegaldesleukin联合nivolumab）的失败对这一策略提出了质疑。本研究旨在重新审视IL-2的生物学机制，特别是CD25在抗肿瘤免疫中的关键作用，并探索一种新的“IL-2Rα偏向性”（IL-2Rα-biased）激动剂策略，以开发更安全有效的IL-2疗法。
三、 详细研究流程与方法 本研究是一项综合性的临床前研究，结合了体外实验、多种小鼠肿瘤模型、单细胞测序、人类肿瘤数据分析以及机制探索。其工作流程可概括为以下几个主要部分：
1. 不同IL-2激动剂的构建与初步功能比较： * 研究材料： 构建了三种人源IL-2-Fc融合蛋白：野生型IL-2（IL-2wt）、破坏CD25结合的“非α”型IL-2（IL-2nα，模拟βγ偏向性类似物）、以及保留CD25结合但减弱与IL-2Rβ结合的“α偏向性”IL-2（IL-2α-bias，即IL-2N88D突变体）。 * 实验方法： * 体外活性检测： 使用小鼠Treg、静息CD8+ T细胞、活化CD8+ T细胞等，通过检测磷酸化STAT5（pSTAT5）水平，评估不同IL-2激动剂对不同细胞亚群的激活效力。 * 体内药效与安全性评估： 在多种小鼠同源肿瘤模型（如MC38、B16F10-OVA、CT26、EMT6、LLC1）中，分别给予IL-2wt、IL-2nα或IL-2α-bias治疗，监测肿瘤生长、小鼠体重变化和生存率。通过流式细胞术分析肿瘤微环境（Tumor Microenvironment, TME）和脾脏、血液等外周组织中各免疫细胞亚群（CD8+ T细胞、Treg、NK细胞等）的比例、增殖（Ki67）和表型（PD-1, CD25）。特别使用OVA肽-MHC四聚体染色追踪肿瘤特异性CD8+ T细胞（Tumor-Specific CD8+ T cells, TSTs）。 * 药代动力学分析： 比较IL-2wt和IL-2nα在小鼠体内的血浆浓度和暴露量（AUC）。
2. 单细胞RNA测序解析肿瘤微环境重塑： * 样本处理： 从经IgG对照、IL-2wt或IL-2nα处理的MC38荷瘤小鼠中分离肿瘤浸润免疫细胞。 * 实验方法： 进行单细胞RNA测序（scRNA-seq），对18,455个细胞进行聚类和生物信息学分析。包括细胞亚群鉴定、轨迹分析、RNA速率分析、差异基因表达分析和基因集富集分析（GSEA），以全面比较IL-2wt和IL-2nα对TME中T细胞、髓系细胞等群体的转录组重塑差异。
3. IL-2Rα偏向性激动剂（IL-2α-bias）的特异性与机制验证： * 研究材料： 使用IL-2α-bias（IL-2N88D）及其“非α”对照IL-2nα/N88D。 * 实验方法： * 特异性验证： 在体外验证IL-2α-bias对CD25+细胞（如活化CD8+ T细胞、Treg）的选择性激活，以及对CD25-细胞（如静息CD8+ T细胞）活性的显著减弱。 * 体内功能验证： 在MC38等模型中，评估IL-2α-bias的抗肿瘤效果，并联合使用CD25阻断抗体、CD8+ T细胞清除抗体等，验证其效应细胞依赖性和CD25信号依赖性。 * 组织选择性分析： 对比分析IL-2α-bias处理小鼠的肿瘤与外周血中，CD8+ T细胞与Treg的比例、增殖状态变化，揭示其在TME与外周的不同免疫调节作用。
4. PD-1+CD25+CD8+ TILs的表征与功能研究： * 实验方法： * 表型分析： 在多种小鼠肿瘤模型和人类结直肠癌组织微阵列中，通过流式细胞术或多重免疫荧光，检测CD8+ TILs中PD-1与CD25的共表达情况。 * 功能关联： 通过体外再刺激（如用MC38肿瘤细胞）检测IFN-γ产生，以及分析已发表的人类肿瘤单细胞数据集中的新抗原反应性TCR（neoTCR）特征，验证PD-1+CD25+ CD8+ TILs富集了肿瘤反应性T细胞（TSTs）。 * 相关性分析： 将不同肿瘤模型中PD-1+CD25+ CD8+ TILs的比例与IL-2α-bias的治疗效果进行关联分析。
5. PD-1阻断与IL-2-CD25自分泌信号通路的机制关联研究： * 实验方法： * 体外Transwell实验： 建立共培养体系，上室和下室分别放置PBMCs，下室加入人工抗原呈递细胞（aAPC）和/或抗PD-1抗体。通过检测培养上清中IL-2水平以及不同隔间CD8+ T细胞中pSTAT5水平，区分自分泌与旁分泌IL-2信号的作用，并分析不同CD8+ T细胞亚群（PD-1/CD25分型）的响应。 * 体外混合淋巴细胞反应（MLR）： 在MLR体系中，加入抗PD-1抗体、CD25阻断剂或IL-2中和抗体，检测IL-2、IFN-γ、TNF-α等细胞因子的分泌，验证IL-2-CD25信号在PD-1阻断效应中的必要性。 * 体内机制验证： 在MC38荷瘤小鼠中，给予抗PD-1抗体、IL-2中和抗体或两者联用，检测肿瘤内CD8+ TILs的IL-2、IFN-γ、TNF-α、颗粒酶B（Gzmb）等分子的产生，以及肿瘤生长情况。
6. IL-2通路特征与抗PD-1临床响应的关联分析及联合治疗探索： * 数据分析： 重新分析两项临床研究（ORIENT-11 NSCLC试验和一项黑色素瘤抗PD-1试验）的批量RNA-seq数据。通过基因集变异分析（GSVA）计算肿瘤样本的“IL-2-STAT5信号通路”特征评分，并将其与患者的客观缓解率、无进展生存期（PFS）和总生存期（OS）进行关联分析。 * 体内联合治疗： 在小鼠中建立“早期衰竭”（小肿瘤）和“晚期衰竭”（大肿瘤）模型。通过RNA-seq分析不同状态肿瘤的转录特征。随后，在大肿瘤模型中，评估IL-2wt、IL-2nα或IL-2α-bias单药或与抗PD-1联合使用的疗效。对治愈小鼠进行肿瘤再攻击，评估免疫记忆的形成。
四、 主要研究结果 1. IL-2wt在体内展现出优于IL-2nα的疗效与安全性： 与预期相反，尽管IL-2wt能更有效地激活Treg，但在多种小鼠模型中，其抗肿瘤效果优于IL-2nα，且体重减轻和动物死亡更少。药代动力学显示IL-2nα暴露量更高，但未能转化为更好疗效。机制上，IL-2wt能更有效地扩增肿瘤内高表达CD25和PD-1的肿瘤特异性CD8+ T细胞（TSTs），而IL-2nα主要扩增无肿瘤特异性的“旁观者”CD8+ T细胞。scRNA-seq证实IL-2wt促进CD8+ T细胞向活化/耗竭状态分化，并上调IL-2/STAT5通路及效应基因。
IL-2Rα偏向性激动剂（IL-2α-bias）具有独特的抗肿瘤特性： IL-2α-bias（IL-2N88D）在体外选择性激活CD25+细胞（如活化CD8+ T细胞、Treg），对CD25-细胞活性极弱。在体内，IL-2α-bias能有效抑制肿瘤生长，且该效应依赖于CD8+ T细胞和CD25信号。有趣的是，它在外周血中扩增Treg，降低CD8/Treg比率，表现出免疫抑制倾向；但在肿瘤内，它显著扩增CD8+ T细胞（尤其是TSTs），减少Treg比例，大幅提升CD8/Treg比率，发挥免疫刺激作用。这种组织选择性效应归因于TME中Treg本已处于高比例、高增殖状态，对额外IL-2刺激反应空间有限，而TME中部分CD8+ TILs高表达CD25，能有效竞争IL-2信号。
PD-1+CD25+ CD8+ TILs是富集肿瘤特异性T细胞的关键群体： 在多种小鼠和人类肿瘤中，PD-1+CD25+ CD8+ TILs的比例显著高于脾脏或正常组织。该群体具有最强的IFN-γ产生能力，且在人类肿瘤单细胞数据中显示最高的新抗原反应性TCR特征。在不同肿瘤模型中，该群体的比例与IL-2α-bias的疗效正相关。
抗PD-1的疗效依赖于PD-1+CD25+ TSTs的自分泌IL-2-CD25信号： 体外Transwell实验证明，PD-1阻断主要增强了活化CD8+ T细胞（尤其是PD-1+CD25+亚群）的自分泌IL-2信号，而非旁分泌信号。在MLR和小鼠模型中，阻断CD25或中和IL-2能显著削弱抗PD-1所诱导的效应细胞因子（如IFN-γ, TNF-α, Gzmb）产生和抗肿瘤效果。
肿瘤IL-2通路特征可预测抗PD-1临床响应： 对临床数据的分析表明，在抗PD-1联合化疗组（ORIENT-11），肿瘤组织高“IL-2-STAT5信号通路”特征的患者，其客观缓解率、PFS和OS均显著优于低特征患者。而在单纯化疗组，该特征无预测价值甚至与较差预后相关。这表明IL-2通路活性特异性地与抗PD-1的机制相关，而非单纯的T细胞浸润指标。
IL-2Rα偏向性激动剂能重塑肿瘤免疫景观并与抗PD-1协同： RNA-seq分析显示，大肿瘤（抗PD-1耐药）的IL-2通路等效应特征低于小肿瘤（敏感）。IL-2wt和IL-2α-bias（而非IL-2nα）处理能显著恢复大肿瘤中这些耗竭/效应相关基因的表达。在抗PD-1耐药的大肿瘤模型中，IL-2α-bias与抗PD-1联合治疗能协同诱导肿瘤完全消退，并产生保护性的免疫记忆。
五、 研究结论与价值 本研究得出结论：CD25在IL-2介导的抗肿瘤免疫中具有不可或缺的作用。肿瘤浸润性PD-1+CD25+ CD8+ T细胞是关键的肿瘤特异性效应细胞群。抗PD-1的疗效依赖于通过激活该群体的自分泌IL-2-CD25信号通路来维持其多功能性。传统的“βγ偏向性”IL-2设计策略因丧失了对CD25+ TSTs的选择性并可能加剧毒性而存在缺陷。相反，一种新的“IL-2Rα偏向性”设计策略（保留CD25结合，减弱IL-2Rβγ结合）能够选择性激活肿瘤内CD25+CD8+ TILs，同时在外周扩增Treg以约束毒性，从而获得更优的治疗窗口。该激动剂能重塑肿瘤免疫微环境，并与抗PD-1疗法产生强效协同，尤其可能使IL-2信号低下的抗PD-1耐药肿瘤患者获益。
本研究的科学价值在于重新定义了CD25在IL-2肿瘤免疫治疗中的核心地位，挑战了既往规避CD25的主流药物设计范式，为下一代IL-2疗法的开发提供了全新的理论依据和强有力的临床前证据。其应用价值在于提出了IL-2Rα偏向性激动剂这一有潜力的联合免疫治疗新策略，并提示肿瘤IL-2通路特征可能作为预测抗PD-1疗效的生物标志物。
六、 研究亮点 1. 重要发现： 明确揭示了PD-1+CD25+ CD8+ TILs是肿瘤内富集肿瘤特异性T细胞的关键功能亚群，并阐明了自分泌IL-2-CD25信号是PD-1阻断发挥疗效的关键下游机制。 2. 范式挑战： 通过严谨的对比实验，证明了保留CD25结合能力的IL-2wt甚至IL-2α-bias，在体内抗肿瘤疗效和安全性上可能优于完全破坏CD25结合的“非α”型IL-2类似物，这对该领域长期以来的主导设计思路提出了直接挑战。 3. 创新策略： 提出并验证了“IL-2Rα偏向性”这一新的工程化策略，通过突变IL-2Rβ界面（如N88D）选择性减弱对二聚体受体的激活，同时保留对三聚体受体的高效激活，实现了对肿瘤内靶点细胞（CD25+ TSTs）的选择性作用与外周毒性的控制。 4. 转化洞察： 将基础研究发现与临床数据紧密结合，不仅在小鼠模型中验证机制，还通过分析真实世界临床样本和测序数据，证实了PD-1+CD25+ T细胞在人类肿瘤中的存在及其功能重要性，以及IL-2通路特征与抗PD-1疗效的相关性，增强了研究的临床指导意义。 5. 研究系统性： 研究设计完整，从分子构建、体外验证、多种小鼠模型体内药效/安全性评价、scRNA-seq深度机制挖掘、到临床数据回溯分析及联合治疗探索，形成了逻辑严密的证据链。
七、 其他有价值内容 研究还指出，CD25的瞬时表达特性使其比PD-1更能标记“近期激活”的T细胞，因此PD-1与CD25共表达能更精确地识别真正的肿瘤反应性T细胞。此外，研究观察到IL-2治疗可诱导TME中髓系细胞（如巨噬细胞、树突状细胞）上PD-L1的表达，这提示了IL-2/STAT5/IFNγ通路介导的免疫负反馈调节，也为联合治疗提供了更多思考角度。