针对CD8+ T细胞驱动纤维化新机制的研究报告

本研究发表于2025年12月19日的《iScience》期刊（卷28，文章号113904）。主要作者为Radboud大学医学中心风湿病学系的Theodoros Ioannis Papadimitriou、Anne van Essen、Merel Willemse等，通讯作者为Arjan van Caam。

学术背景 本研究的科学领域集中于纤维化病理学与免疫学的交叉领域，特别是针对系统性硬化症（Systemic Sclerosis, SSc）等风湿性结缔组织病（Connective Tissue Diseases, CTD）。纤维化的核心特征是细胞外基质（Extracellular Matrix, ECM）过度沉积和组织硬化，成纤维细胞活化形成的肌成纤维细胞（Myofibroblast）是这一过程的关键效应细胞。传统上，CD4+ T辅助细胞因其分泌促纤维化细胞因子（如TGFβ、IL-4、IL-13）的作用而备受关注。然而，近年来在SSc等疾病患者的病变组织（如皮肤、肺）中观察到CD8+ T细胞的大量浸润，尤其是在疾病早期，但其在驱动肌成纤维细胞活化和组织收缩中的具体作用尚不明确。通常，CD8+ T细胞以细胞毒性功能（如抗病毒、杀伤靶细胞）著称，但新近研究发现其存在分泌辅助性细胞因子等“非经典”（Non-canonical）功能。本研究旨在探究：在免疫驱动的组织纤维化中，CD8+ T细胞与CD4+ T细胞相比，谁在驱动肌成纤维细胞活化和收缩中扮演更重要的角色？其背后的分子机制是什么？

详细研究流程 本研究设计并应用了一个创新的三维（3D）细胞共培养模型，并结合了多种分子与细胞生物学技术来解答上述问题。整体工作流程可分为以下几个主要步骤：

1. 构建3D免疫驱动纤维化模型：研究者开发了一个新型的体外3D胶原水凝胶共培养模型。该模型整合了经典的混合淋巴细胞反应（Mixed Lymphocyte Reaction, MLR，用于模拟自体反应性T细胞活化）和3D肌成纤维细胞收缩模型。具体操作是：将原代人类皮肤肌成纤维细胞与异体（Allogeneic）外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMCs）以特定比例（通常为1:5）共同包埋于I型胶原蛋白水凝胶中。使用异体反应性是为了模拟SSc中针对成纤维细胞抗原的自体免疫T细胞反应。这个模型的创新性在于首次在模拟纤维化微环境的3D结构中，系统地研究活化的免疫细胞与肌成纤维细胞之间的动态相互作用。

2. 模型表征与表型分析：

   • 收缩功能评估：共培养后，定期扫描水凝胶并通过图像分析软件（如Fiji）量化其面积收缩百分比，以此评估肌成纤维细胞的收缩活性。本研究使用了来自至少14名不同PBMC供体的样本进行重复验证。
   • 肌成纤维细胞表型分析：在共培养不同时间点（如72小时），通过酶消化法回收水凝胶中的细胞。
     • 流式细胞术：对回收的细胞进行多色流式分析，鉴定肌成纤维细胞（CD45−, CD90+, FAP+），并检测其活化标志物（如FAP、PDPN、HLA-DR、HLA-ABC）的表达水平。同时评估细胞活性（使用可固定活性染料、7-AAD/Annexin V染色）以排除细胞毒性导致的收缩。
     • 免疫组化：对固定的水凝胶切片进行染色，分析胶原、α平滑肌肌动蛋白（αSMA）、PDPN、FAP、PLOD2以及磷酸化STAT3（pSTAT3）、磷酸化Smad2（pSmad2）等蛋白的表达与定位。
     • 基因表达分析：使用荧光激活细胞分选术（Fluorescence-Activated Cell Sorting, FACS）分选出纯化的肌成纤维细胞，通过实时定量PCR（qPCR）检测ECM相关基因（COL1A1, COL3A1）、活化基因（PDPN, IL6, FAP）及抗原呈递基因（HLA-DRB, HLA-ABC）的表达变化。实验涉及了多个原代肌成纤维细胞株（至少6个独立供体）进行验证。

3. 免疫细胞功能分析：

   • 同样通过流式细胞术，在共培养的不同时间点（16, 24, 48, 72小时）分析PBMCs中CD4+和CD8+ T细胞的活化状态（CD25, CD69, CD134）、细胞因子产生（IL-2, IFNγ, IL-4, IL-13, IL-6）以及细胞毒性相关分子（颗粒酶B/Granzyme B，颗粒酶K/Granzyme K）的表达。
   • 使用负向磁珠分选法从健康供体PBMCs中分离出CD3+ T细胞、CD4+ T细胞和CD8+ T细胞（纯度>95%），分别与肌成纤维细胞共培养，以直接比较不同T细胞亚群诱导收缩的能力。

4. 机制探究实验：

   • 可溶性因子作用验证：将共培养体系的上清液转移至仅含肌成纤维细胞的新鲜水凝胶中，观察是否能诱导收缩，以此验证细胞因子等可溶性介质的作用。并使用Luminex或ELISA等方法检测上清液中细胞因子的种类和浓度。
   • 信号通路抑制实验：为了阐明驱动收缩的关键信号通路，在共培养体系中加入特异性小分子抑制剂。
     • 使用JAK/STAT通路抑制剂托法替尼（Tofacitinib）和STAT3特异性抑制剂Static。
     • 使用TGFβ受体（ALK4/5/7）抑制剂SB-505124。
     • 评估单独或联合使用这些抑制剂对水凝胶收缩、肌成纤维细胞基因/蛋白表达以及T细胞功能的影响。
   • 报告基因检测：构建稳定表达由SIS诱导元件（Sis-Inducible Element, SIE，主要响应STAT3）或TGFβ反应元件驱动的荧光素酶报告基因的肌成纤维细胞系。用共培养上清刺激这些报告细胞，通过检测荧光素酶活性来量化STAT3和TGFβ信号通路的激活程度。
   • 细胞因子产生阻断：在共培养前，用高尔基体阻断剂布雷菲德菌素A（Brefeldin A, BFA）预处理T细胞，以阻断其细胞因子的分泌，随后观察对肌成纤维细胞收缩和活化的影响。

5. 数据分析：研究采用了严格的统计学方法。对于多组比较，主要使用双向方差分析（Two-way ANOVA），并进行Sidak’s或Tukey’s多重比较检验。对于配对样本或重复测量数据，使用配对t检验或重复测量方差分析。数据以均值±标准差表示，显著性水平设为 *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001。

主要研究结果 1. CD8+ T细胞是驱动肌成纤维细胞收缩的主要力量：在构建的3D共培养模型中，PBMCs能强烈诱导肌成纤维细胞收缩（72小时内收缩约85%），而单独的肌成纤维细胞无自发收缩。关键发现是，纯化的CD8+ T细胞诱导的收缩强度显著高于CD4+ T细胞。这种收缩并非由细胞毒性导致，因为共培养并未增加肌成纤维细胞的凋亡（Caspase-3活性、γH2AX染色、Annexin V/7-AAD流式分析均显示阴性或极低水平）。

1. 共培养诱导肌成纤维细胞向病理表型转化：与PBMCs共培养后，肌成纤维细胞表现出类似疾病状态的活化表型：抗原呈递能力增强（HLA-DR和HLA-ABC表达上调）、活化标志物表达升高（FAP, PDPN, IL6）、胶原交联酶PLOD2表达增加。然而，经典ECM基因（如COL1A1）表达未显著变化，提示早期活化可能更侧重于免疫调节和收缩功能，而非大量基质沉积。

2. CD8+ T细胞通过分泌IL-6等细胞因子驱动STAT3信号激活：机制研究发现，CD8+ T细胞比CD4+ T细胞产生更多的IL-6。使用BFA阻断CD8+ T细胞的细胞因子分泌，可完全抑制其诱导的肌成纤维细胞STAT3报告基因活性，并降低肌成纤维细胞中PDPN、IL6和HLA-DR的表达。这表明CD8+ T细胞通过分泌IL-6等可溶性因子，以STAT3信号依赖的方式激活肌成纤维细胞。上清转移实验能诱导收缩也证实了可溶性介质的关键作用。

3. JAK/STAT3与TGFβ信号通路协同驱动活化过程：免疫组化显示，共培养后肌成纤维细胞内pSTAT3和pSmad2水平均显著升高。药理抑制实验证明，单独抑制JAK/STAT3通路（用托法替尼或Static）或TGFβ通路（用SB-505124）均可显著减弱免疫细胞诱导的肌成纤维细胞收缩。更重要的是，两种抑制剂联合使用产生了明显的叠加效应，几乎完全阻止了收缩。这表明两条通路在驱动肌成纤维细胞活化中存在协同作用。

4. 信号通路抑制剂的细胞特异性效应：通路抑制剂对T细胞功能的影响具有亚群特异性。托法替尼和SB-505124均能降低CD8+ T细胞的IL-6产生，但对CD4+ T细胞的IL-6和IFNγ产生影响不大。此外，托法替尼还能抑制CD8+ T细胞的颗粒酶B表达。这些结果进一步将CD8+ T细胞的细胞因子产生（而非细胞毒性）与肌成纤维细胞活化联系起来。

结论与意义 本研究揭示了CD8+ T细胞在驱动组织纤维化中一个此前未被充分认识的“非经典”作用。主要结论是：在免疫介导的组织收缩和纤维化启动过程中，CD8+ T细胞通过分泌IL-6等细胞因子，激活肌成纤维细胞内的JAK/STAT3信号通路，并与TGFβ信号协同，强力驱动肌成纤维细胞的活化和收缩，其作用强于CD4+ T细胞。这一过程不依赖于经典的细胞毒性杀伤机制。

其科学价值在于： 1. 提供了新的病理机制见解：为理解SSc等CTD中CD8+ T细胞浸润的病理意义提供了直接实验证据，将CD8+ T细胞从传统的“杀伤者”角色扩展为重要的“纤维化驱动者”。 2. 揭示了关键治疗靶点：明确了STAT3和TGFβ信号通路在CD8+ T细胞驱动的肌成纤维细胞活化中的核心地位，并证明联合靶向这两条通路具有叠加疗效，这为开发新的抗纤维化联合疗法（如JAK抑制剂联合TGFβ通路抑制剂）提供了强有力的理论依据。 3. 开发了具有转化价值的研究工具：所建立的3D免疫-基质细胞共培养模型，比传统的MLR或二维培养更能模拟体内纤维化微环境的复杂性，可用于高通量药物筛选和更深入的机制研究。

研究亮点 1. 重要发现：首次在功能性实验中直接证明CD8+ T细胞在诱导肌成纤维细胞收缩方面比CD4+ T细胞更强，并阐明其不依赖细胞毒性、而是依赖细胞因子（IL-6）驱动STAT3信号的分子机制。 2. 方法创新：成功构建了一个整合免疫激活与基质细胞反应的3D人源化纤维化模型，该模型能够同时模拟T细胞活化、肌成纤维细胞收缩、表型转化等多个病理过程，具有良好的生理相关性和可操作性。 3. 治疗启示：明确提出并验证了针对CD8+ T细胞-肌成纤维细胞轴的双重通路抑制策略（JAK/STAT + TGFβ）的有效性，为难以治疗的纤维化疾病提供了新的潜在治疗思路。

其他有价值内容 研究也坦诚地指出了其局限性：模型基于异体反应，其T细胞受体（TCR）信号强度可能强于自身免疫反应；未全面分析单核/巨噬细胞等其他免疫细胞的作用；使用的是健康供体的PBMCs和皮肤肌成纤维细胞，未来需要使用患者来源的细胞进行验证以增强临床相关性。这些为后续研究指明了方向。