本研究报告源自一篇由Ayaka Sugiura、Gabriela Andrejeva、Kelsey Voss等多位作者共同完成，通讯作者为Jeffrey C. Rathmell的研究论文。该研究于2022年1月11日发表在顶级免疫学期刊 Immunity 上，标题为“MTHFD2 is a metabolic checkpoint controlling effector and regulatory T cell fate and function”。参与研究的主要机构包括范德堡大学医学中心、普林斯顿大学、爱荷华大学以及Sitryx Therapeutics公司等。

本研究的学术背景聚焦于免疫代谢学领域，特别是探索代谢重编程如何调控CD4+ T细胞的分化与功能。众所周知，当T细胞被抗原激活后，会经历剧烈的代谢重组，从静息状态转向高速生长和增殖的合成代谢状态，以满足其生物合成、能量需求和信号传导的剧增。不同的细胞因子环境引导初始CD4+ T细胞分化为具有不同效应功能的效应T细胞和调节性T细胞亚群，它们各自拥有独特的代谢程序。例如，在自身免疫性疾病如多发性硬化症中，白细胞介素-17产生的辅助性T细胞17（Th17细胞）增多而具有抑制功能的调节性T细胞（Treg细胞）减少或功能失调。通过靶向特定T细胞亚群的代谢程序来调节免疫反应，是免疫治疗的一种新兴策略。单碳代谢是叶酸代谢的核心通路之一，为嘌呤合成、甲基供体生成和氧化还原平衡所必需。该通路中的酶（如MTHFD2）在多种肿瘤中高度表达，但在大多数成人组织中表达极低或没有，使其成为潜在的高选择性治疗靶点。然而，MTHFD2在T细胞，特别是在炎症和自身免疫背景下不同效应与调节性T细胞亚群中的具体作用尚不清楚。因此，本研究旨在探究MTHFD2是否作为控制CD4+ T细胞命运和功能的代谢检查点，并评估其作为炎症性疾病治疗靶点的潜力。

研究的工作流程详尽且层次分明，包含了从筛选、机制探索到功能验证的多个环节。首先，研究团队通过非靶向代谢组学分析了体外分化的Th1、Th17和Treg细胞中的核苷酸代谢物水平，发现嘌呤合成中间体在不同亚群中存在差异，其中Th17细胞中积累的甘氨酰胺核苷酸、SAICAR和AICAR水平最高。这提示核苷酸合成，尤其是嘌呤代谢，可能在不同T细胞亚群中扮演不同角色。基于此，研究团队设计了一项靶向体内CRISPR-Cas9筛选，以系统性评估单碳代谢通路中哪些基因对CD4+ T细胞的体内扩增和功能至关重要。他们构建了一个靶向单碳代谢相关酶（以TSC2作为阳性对照，非靶向序列作为阴性对照）的向导RNA文库。将文库转导至来源于OT-II Cas9双转基因小鼠（卵清蛋白特异性T细胞受体）的初始CD4+ T细胞中，然后将这些细胞过继转移至Rag1缺失的宿主小鼠体内，再通过鼻内给予卵清蛋白诱导肺部炎症模型。最后，从肺部回收T细胞并进行测序分析，以鉴定与输入池相比显著富集或耗竭的向导RNA。筛选结果显示，MTHFD2的向导RNA显著耗竭，表明MTHFD2的缺失可能损害了T细胞在炎症环境中的增殖和/或存活。进一步分析公共数据库发现，MTHFD2在活化的T细胞中表达上调最为显著，且在多种人类炎症和自身免疫疾病患者的血液样本中持续高表达。这些发现共同将MTHFD2确立为后续深入研究的核心靶点。

接着，研究团队在体外和体内验证了MTHFD2的功能。在体外，他们使用MTHFD2特异性抑制剂（MTHFD2i， DS18561882）或通过构建条件性敲除小鼠（Mthfd2fl/fl Cd4-cre， 简称Cd4ΔMthfd2），研究了MTHFD2活性缺失对小鼠CD4+ T细胞亚群的影响。结果发现，MTHFD2抑制或缺失会广泛损害Th1和Th17细胞的增殖、活化和细胞因子产生。但更关键的发现是，MTHFD2的抑制特异性地诱导了Th17细胞中转录因子Foxp3的异常上调，并赋予这些Th17细胞抑制CD8+ T细胞增殖的能力，即获得了类似Treg细胞的表型和功能。同时，在低浓度TGF-β条件下分化的诱导性Treg细胞，其Foxp3的表达因MTHFD2抑制而得到增强。代谢表型分析（使用Seahorse细胞能量代谢分析仪）显示，MTHFD2i处理的Th17细胞基础耗氧率和最大耗氧率增加，而细胞外酸化率降低，表明其代谢程序从糖酵解向氧化磷酸化转变，这与Treg细胞典型的代谢特征相符。为了确认这些发现在人类系统中的相关性，研究团队使用原代人外周血CD4+ T细胞进行实验，证实MTHFD2抑制剂同样能抑制人Th17细胞的增殖，诱导Foxp3表达，并降低mTORC1信号活性。这些结果共同表明，MTHFD2的活性是限制Th17细胞获得Treg样特征、同时促进Treg细胞分化的关键检查点。

为了阐明其作用机制，研究团队进行了一系列深入的机制探索。他们首先通过代谢物质谱分析发现，短期（4-6小时）MTHFD2i处理会导致所有CD4+ T细胞亚群中嘌呤合成中间体（如GAR、SAICAR、AICAR）的积累，同时嘌呤核苷酸（特别是鸟嘌呤）池耗竭。而补充1mM甲酸盐（MTHFD2的代谢产物）可以逆转这些代谢物水平的变化，表明表型依赖于MTHFD2的酶活性。功能挽救实验进一步支持了这一观点：在培养体系中添加甲酸盐或嘌呤碱基（腺嘌呤和鸟嘌呤），可以恢复因MTHFD2抑制或缺失而受损的T细胞增殖、活化及细胞因子产生。值得注意的是，Th17细胞中Foxp3的异常上调能被外源性嘌呤挽救，但甲酸盐不能，提示除了嘌呤核苷酸合成不足，可能还有其他通路参与了Foxp3的表观遗传调控。由于积累的AICAR是AMPK的激活剂，而鸟嘌呤耗竭可抑制mTORC1的激活因子Rheb，研究团队检测了mTORC1信号通路。结果显示，MTHFD2抑制降低了所有T细胞亚群中磷酸化S6的水平，表明mTORC1活性受损。同时，参与Th17细胞分化的关键因子HIF-1α的表达也下降。这些信号变化可能共同推动了代谢重编程和细胞命运转变。此外，MTHFD2i处理的Th17细胞中三羧酸循环中间体（如琥珀酸、富马酸）水平下降，这两种代谢物是DNA和组蛋白去甲基酶的抑制剂。通过CUT&RUN测序和靶向亚硫酸氢盐测序分析，研究团队发现MTHFD2i处理的Th17细胞基因组范围内组蛋白H3K27三甲基化水平降低，并且Foxp3基因近端启动子区域的DNA甲基化频率显著下降。这为MTHFD2抑制促进Foxp3表达提供了潜在的表观遗传学解释。

最后，研究团队在多种小鼠炎症和自身免疫模型中进行体内验证，评估靶向MTHFD2的治疗潜力。在迟发型超敏反应模型中，口服MTHFD2抑制剂能显著减轻耳朵的炎症性肿胀。在实验性自身免疫性脑脊髓炎模型中，无论是使用MTHFD1/2双抑制剂LY345899进行治疗，还是利用Cd4ΔMthfd2小鼠进行遗传学干预，均能显著降低疾病严重程度和临床评分。对EAE模型小鼠中枢神经系统的分析显示，Cd4ΔMthfd2小鼠脊髓中浸润的CD4+ T细胞总数减少，Foxp3+细胞相对于T-bet+和RORγt+细胞的比值升高，这与体外观察到的Th17细胞向Foxp3+表型偏移的趋势一致。此外，在炎症性肠病模型中，过继转移Cd4ΔMthfd2 naive CD4+ T细胞至Rag1缺失小鼠诱导的结肠炎，其体重减轻程度远低于接受野生型T细胞的小鼠，且肠道引流淋巴结中T细胞数量和炎症性亚群减少，而Foxp3+细胞频率相对增加。这些体内实验强有力地证明，靶向MTHFD2可以在多种病理背景下有效缓解T细胞驱动的炎症和自身免疫反应。

本研究得出的结论是，MTHFD2是CD4+ T细胞中的一个关键代谢检查点。它通过维持线粒体嘌呤从头合成，进而支持mTORC1信号通路，来促进效应T细胞（尤其是Th17细胞）的增殖和炎症功能。同时，MTHFD2的活性抑制了Th17细胞不恰当地获得Foxp3表达和抑制功能，并限制了Treg细胞的分化。其作用机制涉及嘌呤中间体积累、核苷酸池耗竭、mTORC1信号抑制、代谢向氧化磷酸化偏移以及随之而来的表观遗传景观改变（如DNA和组蛋白甲基化水平变化）。因此，靶向抑制MTHFD2能够将免疫平衡从促炎状态转向抗炎状态，从而在多种疾病模型中发挥保护作用。

本研究的价值与意义重大。首先，它在科学层面深化了我们对免疫代谢的理解，揭示了嘌呤代谢不仅是支持细胞增殖的生物合成需求，更是调控T细胞分化和命运决定的关键信号来源。MTHFD2作为一个节点，将代谢状态与关键的信号通路（如mTORC1）和表观遗传修饰联系起来，从而精细调控Th17/Treg细胞的平衡。其次，在应用层面，研究明确提出了MTHFD2是治疗炎症和自身免疫疾病的一个极具前景的新靶点。鉴于MTHFD2在大多数健康成人组织中表达极低，而在活化的T细胞和炎症病灶中高度上调，靶向它可能实现更高的选择性，从而减少传统抗叶酸药物（如甲氨蝶呤）常见的广泛副作用，为开发更安全、更有效的免疫代谢疗法提供了新的方向。

本研究的亮点突出：第一，发现了MTHFD2在Th17细胞向Treg样表型转化中的独特调节作用，这是一个新颖且重要的发现；第二，采用了体内原发性T细胞CRISPR筛选这一强大工具，从功能上无偏倚地鉴定出关键基因；第三，研究机制阐释深入且全面，从代谢流、信号传导到表观遗传进行了多层次的解析；第四，体内外模型结合紧密，从细胞、小鼠模型到人原代细胞验证，再到多种疾病模型的疗效评估，构成了完整的证据链；第五，明确了MTHFD2酶活性是其主要功能基础，并利用代谢物补充实验进行了有力验证，为药物开发奠定了坚实的理论基础。

总而言之，这项由Sugiura等人领导的研究，成功地将MTHFD2确立为连接代谢、表观遗传与T细胞命运的核心检查点，不仅拓展了免疫代谢学的前沿认知，也为治疗一系列T细胞介导的炎症性疾病开辟了极具潜力的新途径。