本研究由Eutteum Jeong、Han Kyoung Choi、Jin Hee Park和Soo Young Lee完成，通讯作者为Soo Young Lee，研究团队来自韩国梨花女子大学生命科学系及细胞稳态研究中心。该论文发表于《cell death & differentiation》期刊，2018年1月18日在线发表，刊载于该期刊2018年第25卷第1364至1374页。
本研究的学术背景聚焦于骨骼生物学中破骨细胞分化的调控机制。骨骼稳态的维持依赖于成骨细胞的骨形成与破骨细胞的骨吸收之间的动态平衡，该平衡一旦被打破，便会引发类风湿关节炎、骨质疏松等多种骨骼疾病。破骨细胞是由单核/巨噬细胞前体分化而来的多核细胞，其分化过程受巨噬细胞集落刺激因子和核因子κB受体活化因子配体（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）的协同调控。RANKL与破骨细胞前体表面的核因子κB受体活化因子（receptor activator of nuclear factor-κB，RANK）结合后，招募肿瘤坏死因子受体相关因子6，进而激活下游丝裂原活化蛋白激酶和核因子κB信号通路。此外，接头蛋白Grb-2相关结合蛋白2（Grb-2-associated binder 2，GAB2）与磷脂酶Cγ2（phospholipase Cγ2，PLCγ2）形成RANK信号复合体，在破骨细胞生成信号的传递中发挥关键作用。Bruton酪氨酸激酶（Bruton tyrosine kinase，BTK）和酪氨酸蛋白激酶TEC则通过连接RANK信号与免疫受体酪氨酸活化基序信号，促进PLCγ2磷酸化及下游钙信号动员。虽然关于RANK信号的正向调控已有较多报道，但关于RANK信号如何在细胞内被负向限制的机制仍不明确。基于此背景，本研究旨在寻找RANKL诱导的负调控分子，以揭示破骨细胞分化过程中信号终止的新机制。
在具体研究流程方面，该研究主要包含四个递进环节。首先，研究团队通过基因芯片分析筛选RANKL刺激后表达显著变化的基因，发现src同源3结构域和富含半胱氨酸结构域蛋白2（src homology 3 domain and cysteine-rich domain-containing protein 2，STAC2）的mRNA水平在RANKL刺激72小时后升高4.58倍，并通过蛋白质印迹和实时定量PCR证实STAC2在破骨细胞分化过程中的蛋白和mRNA水平均随时间显著上调。进一步的功能调控分析表明，RANKL诱导的STAC2表达依赖于活化T细胞核因子1（nuclear factor of activated T cells c1，NFATc1）。使用钙调磷酸酶/NFAT抑制剂环孢素A可显著抑制STAC2蛋白表达，而逆转录病毒介导的组成性活化NFATc1过表达则可在无RANKL刺激条件下诱导STAC2表达。此外，通过STAC2启动子荧光素酶报告基因实验，研究团队确认了STAC2启动子区域中一个NFATc1结合位点（BS2）在NFATc1介导的STAC2转录激活中起关键作用。
研究流程的第二部分考察了STAC2对破骨细胞分化的功能影响。研究人员利用逆转录病毒系统在小鼠骨髓来源巨噬细胞中过表达STAC2，并以抗酒石酸酸性磷酸酶染色阳性且细胞核数不少于10个的多核细胞作为成熟破骨细胞的标志。结果显示，STAC2过表达显著减少RANKL诱导的破骨细胞形成数量，同时下调NFATc1和ATP6V0D2等破骨细胞标志蛋白的表达。与之相对，通过小干扰RNA敲低STAC2后，破骨细胞形成显著增强，NFATc1表达也随之升高。在牙本质切片上进行的骨吸收陷窝实验进一步证明STAC2过表达显著降低骨吸收面积。值得注意的是，STAC家族另一成员STAC1和STAC3的过表达对破骨细胞分化及骨吸收均无影响，且STAC2过表达也不影响骨形态发生蛋白诱导的成骨细胞分化，说明STAC2对破骨细胞具有相对特异性的负调控作用。
第三部分聚焦于STAC2对RANK信号通路的分子机制研究。信号通路分析显示，STAC2过表达显著抑制RANKL诱导的JNK、p38、ERK磷酸化以及IκBα降解，表明STAC2可同时减弱丝裂原活化蛋白激酶和核因子κB通路的活化。然而，STAC2过表达并不影响M-CSF和脂多糖诱导的相应信号通路，提示STAC2对RANKL-RANK轴具有选择性抑制作用。进一步通过免疫共沉淀和GST下拉实验，研究团队发现STAC2能够与RANK发生物理相互作用，且这种结合在RANKL刺激后更为明显。利用一系列RANK胞内段突变体，研究确认RANK高度保守区中的IVVY基序（第535至538位氨基酸）是STAC2与RANK结合的关键位点。同时，通过对STAC2缺失突变体的分析，发现STAC2的锌指结构域和SH3结构域在抑制破骨细胞形成中起关键作用，而富含脯氨酸结构域则非必需。
第四部分揭示了STAC2对RANK信号复合体的解聚作用。在293T细胞中共表达RANK、GAB2、PLCγ2和STAC2后发现，随着STAC2表达剂量增加，GAB2和PLCγ2与RANK的结合被逐步削弱。在骨髓来源巨噬细胞中过表达STAC2同样抑制了RANKL刺激后PLCγ2和GAB2与RANK的免疫共沉淀。此外，STAC2过表达可抑制BTK或TEC介导的PLCγ2磷酸化，并减弱PLCγ2与BTK/TEC之间的相互作用，而STAC2自身仍可与BTK/TEC结合。在RANKL诱导的前破骨细胞中，STAC2过表达同样抑制内源性PLCγ2与BTK的结合及PLCγ2磷酸化。这些结果表明STAC2通过双重机制发挥负调控作用：一方面破坏RANK与GAB2/PLCγ2信号复合体的形成，从而抑制核因子κB和丝裂原活化蛋白激酶通路；另一方面阻断BTK/TEC介导的PLCγ2活化，进而抑制下游钙信号和NFATc1的诱导。
综合以上结果，本研究得出的结论是STAC2是一种新型的RANKL诱导蛋白，通过直接结合RANK的IVVY基序，破坏RANK信号复合体的组装，并抑制BTK/TEC介导的PLCγ2磷酸化，从而负向调控破骨细胞的分化和骨吸收功能。这一发现为破骨细胞生成的负调控机制提供了新的分子解释，尤其在信号终止层面补充了以往对转录抑制因子和分泌型抑制分子研究的不足。与靶向M-CSF受体信号的SHIP-1和靶向白细胞介素-1受体通路的IRAK-M不同，STAC2直接作用于RANK受体信号，因而具有独特的调控位点。从应用价值来看，STAC2所介导的负反馈回路在维持生理性骨稳态和限制炎症状态下的骨丢失方面具有重要意义，未来有望成为骨骼疾病治疗干预的新靶点。
本研究的亮点在于：首次鉴定STAC2为RANKL诱导的破骨细胞负调控因子；发现STAC2通过结合RANK高度保守区中的IVVY基序发挥作用；阐明STAC2不仅破坏RANK信号复合体形成，也干扰BTK/TEC与PLCγ2的偶联，从而实现对多条下游信号通路的协同抑制；同时证明STAC2的作用具有RANKL特异性，而不影响M-CSF或脂多糖介导的信号通路。这些特点使得STAC2成为一个具有潜在药理开发价值的骨骼保护性分子。