主要作者与发表信息
该研究由香港城市大学生物医学科学系及董氏生物医学科学中心的Jiao Zhai与Mengsu Yang等人完成，合作单位包括河北工业大学、天津理工大学、中国医学科学院放射医学研究所、澳门大学微电子研究院等。论文于2025年9月12日在线发表于 Talanta 期刊（第298卷，2026年，文献号128833），通讯作者为Jiao Zhai和Mengsu Yang。
研究背景与目的
该研究属于数字微流控（digital microfluidics, DMF）技术与单细胞分析交叉领域。在癌症研究中，传统基于大量细胞群体的分析方法仅能提供平均信息，掩盖了细胞间异质性，尤其是循环肿瘤细胞（circulating tumor cells, CTCs）和干细胞等稀有细胞亚群的遗传特征。单细胞分析对于揭示肿瘤演化、转移和耐药机制至关重要。
现有单细胞分离技术各有局限：液滴微流控依赖泊松分布加样，产生大量空液滴或多细胞液滴，不适用于珍贵稀有样本；微结构芯片易发生细胞堆积和堵塞；微阀系统操作复杂且依赖辅助设备。数字微流控通过电场精确操控液滴，具有个体控制、多步骤处理和自动化的优势，但现有亲水图案制备方法——Teflon剥离（lift-off）技术——存在工艺复杂、Teflon层易分层或剥离损伤、以及操作电压过高（≥100 V）可能造成DNA损伤等问题。
本研究旨在开发一种新型的Teflon湿法（teflon wet-on）技术，用于在DMF芯片上制备亲水图案，以简化工艺流程、降低操作电压，并实现对单个肿瘤细胞的高效、确定性分离及后续基因组异质性分析。
研究流程
1. DMF芯片设计与Teflon湿法亲水图案制备
DMF芯片由铬图案化玻璃底板、氧化铟锡（indium tin oxide, ITO）玻璃顶板和150 μm导电胶带间隔层组成，整体尺寸为76.2 mm × 50.8 mm。芯片包含三个大电极作为PBS、细胞和废液储液池，三个小亲水图案电极用于单细胞分离，以及连接电极用于液滴运输。
Teflon湿法技术的核心流程为：在完成标准芯片制备（涂覆介电层和疏水Teflon层）后，对Teflon表面进行等离子体处理以增强润湿性，随后通过SU-8光刻胶光刻定义亲水区域，最后在185 °C下硬烘烤15分钟。该方法完全消除了剥离步骤，仅需四步即可完成。
2. 等离子体处理参数的系统优化
研究考察了不同功率（50 W、80 W、120 W）和处理时间对Teflon表面润湿性可逆性的影响。通过接触角测量发现，120 W（4分钟）处理后表面高度亲水（接触角11.7°±0.5°），但加热后仅部分恢复疏水性（61.7°±5.0°），表明发生了不可逆损伤。50 W处理虽保持良好的可逆性，但润湿性调控幅度有限。80 W（4分钟）达到最佳平衡：处理后接触角降至35°±2°，加热后完全恢复至104°±2°，且经过五个等离子体-烘烤循环后接触角仍维持在90°以上。
傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectroscopy, FTIR）分析显示，等离子体处理后Teflon的CF₂（1215 cm⁻¹、1155 cm⁻¹）和CF₃（982 cm⁻¹）特征峰保留，表明聚合物主链完整；同时出现1640 cm⁻¹的新峰（C–O伸缩振动），证明表面发生了氧等离子体诱导的氧化官能团化。原子力显微镜（atomic force microscopy, AFM）显示，处理后表面粗糙度从0.5 nm增加至1.6 nm（4分钟），与润湿性改善相关。
3. 单细胞分离参数的系统评估
研究以MDA-MB-231乳腺癌细胞为主要模型，系统评估了亲水图案尺寸、细胞浓度、操作电压和细胞大小对单细胞分离效率的影响。实验使用90 V操作电压，测试了300至600 μm直径的圆形亲水图案。单细胞分离采用被动分配策略：将细胞悬液液滴运输至带亲水图案的目标电极，通过激活相邻电极使主液滴移开，在亲水区域留下微小残滴，随后用含0.1% Pluronic F127的PBS反复稀释，逐步减少图案区域内细胞数直至只剩一个细胞。
研究发现，在低于8×10⁴ cells/ml的细胞浓度下，所有尺寸图案均无法实现单细胞分离；在8×10⁴ cells/ml时，500 μm和600 μm图案成功分离出单细胞。分离时间随细胞浓度增加而延长。电压测试显示，在高细胞浓度（5×10⁵–5×10⁶ cells/ml）下提高操作电压可显著缩短分离时间，而低浓度下电压影响甚微。使用H1299（平均直径22.2 μm）、SW1116（19.8 μm）和U937（16.5 μm）三种细胞系比较发现，细胞大小对分离时间无显著影响，因亲水图案尺寸远大于细胞直径差异，且电润湿力均匀作用于整个液滴。在优化条件下（500 μm图案、80 V，细胞浓度5×10⁵ cells/ml），未干预的平均单细胞占据率为80%（每轮3个捕获位点中有2.4个成功），单细胞产率为0.48%。通过操作员引导的校正手段（回收并重新稀释丢失细胞），捕获位点占据率可达100%。
4. 操作电压对DNA损伤的评估
为确保细胞完整性，研究采用γH2AX免疫荧光法——DNA双链断裂（double-strand breaks, DSBs）的最早期标志物——评估了不同操作电压下的DNA损伤。细胞在70–100 V电压下进行2小时闭环循环暴露后，100 V组显示出显著增强的红色荧光信号，表明DSBs明显增加，而70–90 V组与未处理对照组无显著差异。先前研究表明，高电压液滴操作可产生超过40 °C的局部温升，而过度热应激可导致DNA损伤。因此，该研究建议将操作电压控制在100 V以下，以确保基因组稳定性。
5. 单细胞全基因组测序与异质性分析
使用Teflon湿法技术制备的DMF芯片，研究团队分离了十个MDA-MB-231单细胞并进行全基因组测序（whole-genome sequencing, WGS）。由于单细胞WGS面临扩增偏倚、全基因组扩增不均匀、DNA降解和文库制备伪影等技术挑战，最终仅有三个细胞通过质量控制和得到高质量测序数据。尽管样本量有限，三个成功测序的细胞展现出显著的基因组多样性：每个细胞均显示不同的染色体间易位（转位）模式，突变基因的功能富集分析也揭示了三细胞间受影响通路的差异。这一结果即使在同源细胞系中也存在显著的遗传改变异质性。
研究结论与应用价值
本研究成功开发了Teflon湿法技术，相较传统Teflon剥离技术具有以下优势：工序更简单（4步 vs 5步，无需剥离）；Teflon层更稳定，不易损伤或分层；操作电压更低（70–90 V vs 100–210 V），为敏感且长时间的单细胞全基因组测序实验提供了关键的安全裕度；临床适用性更好，无DNA损伤风险。
该低通量DMF系统特别针对CTC研究进行了优化，结合了精确分离、单细胞追踪和温和处理的特点，可保护脆弱细胞和CTC簇用于转移研究。与高通量方法相比，该系统以准确性优先于速度，使其成为检测稀有突变、个性化治疗测试和长期CTC监测的理想工具。其应用范围涵盖单细胞基因组学、药物筛选和多组学分析。未来可通过电极共享逻辑等方案提升通量，在不牺牲性能的前提下扩展容量。
研究亮点
本研究的核心创新在于Teflon湿法技术的开发。通过在已固化的Teflon表面直接进行等离子体处理和光刻，实现了润湿性的可逆调控，简化了制造工艺的同时避免了剥离过程对疏水层的损伤。该技术使DMF芯片在70–90 V的低电压下即可稳定工作，避免了高电压可能引发的DNA双链断裂，这一安全性优势对于下游基因组分析至关重要。研究还系统揭示了亲水图案尺寸、细胞浓度、操作电压与单细胞分离效率之间的定量关系，为确定性和高回收率的稀有细胞分离提供了重要的参数指导。