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本研究由Giovanni Almanzar、Matthias Klein、Marc Schmalzing等作者共同完成，研究机构包括德国维尔茨堡大学医院儿科风湿病学与特殊免疫学部门、风湿病学与临床免疫学部门、人类遗传学研究所、皮肤病学与性病学及过敏学部门、病理学研究所等。研究发表于2016年12月1日的《International Archives of Allergy and Immunology》期刊，DOI为10.1159/000450949。
系统性硬化症（Systemic Sclerosis, SSc）是一种以皮肤和内脏器官纤维化为特征的炎症性疾病，T细胞在其发病机制中起重要作用。研究发现，Th17细胞（T helper 17 cells）和调节性T细胞（Regulatory T cells, Tregs）之间的失衡可能与SSc的病理过程相关。然而，Th17和Tregs在SSc中的具体作用及其转录因子（如RORC和FOXP3）的甲基化状态尚未完全阐明。本研究旨在探讨SSc患者中Th17和Tregs的表型和功能特征，并分析其转录因子表达及甲基化状态与疾病表现和炎症活动的关系。
研究人群
研究纳入了26名SSc患者（17名局限性皮肤SSc患者和9名弥漫性皮肤SSc患者）和29名健康对照者（HC）。所有参与者均来自维尔茨堡大学医院，研究经当地伦理委员会批准，并获得了参与者的书面知情同意。
淋巴细胞分离
从外周血中通过密度梯度离心法分离出外周血单核细胞（PBMCs），并将其悬浮于RPMI 1640培养基中。
T细胞表面及细胞内染色
PBMCs用荧光标记的单克隆抗体（如CD3、CD4、CCR6、CD25、CD127等）进行表面染色，随后通过固定和透化处理进行细胞内染色（如FOXP3、RORγt、IL-17等）。染色后的细胞通过流式细胞术（FACS）进行分析，数据使用FACSDiva软件处理。
血清细胞因子水平检测
使用流式细胞术检测血清中Th1、Th2、Th9、Th17、Th22相关细胞因子的水平。
抑制实验
从PBMCs中分离出CD4+CD25+CD127- Tregs，并与CFSE标记的自体PBMCs共培养，通过抗CD3/CD28刺激后，评估Tregs对淋巴细胞增殖的抑制功能。
亚硫酸氢盐焦磷酸测序
对PBMCs中的DNA进行亚硫酸氢盐转化，随后通过焦磷酸测序分析RORC1、RORC2、FOXP3、STAT3和STAT5A的甲基化状态。
PCR分析
提取PBMCs中的总RNA，通过逆转录生成cDNA，并使用实时荧光定量PCR（qPCR）检测FOXP3、RORC、STAT3、STAT5、CCR6、IL-10和IL-17的基因表达水平。
Th17和Tregs的分布与功能
研究发现，弥漫性皮肤SSc患者外周血中IL-17产生的CCR6+ Th细胞和FOXP3+ Tregs同时增加。Tregs的抑制功能在SSc患者中显著降低，特别是在高炎症活动患者中。
转录因子表达与甲基化状态
SSc患者中RORC1和RORC2基因显著高甲基化，且与高炎症活动相关。FOXP3启动子和增强子区域的甲基化状态与炎症参数相关，女性患者中FOXP3启动子区域的高甲基化更为显著。
细胞因子表达
SSc患者外周血淋巴细胞中IL-17和CCR6的基因表达显著升高，但血清中IL-17水平未显著增加。IL-10在Tregs中的产生较低，但在CD4+ T细胞亚群中显著增加。
抑制功能分析
SSc患者来源的Tregs对自体淋巴细胞增殖的抑制功能显著低于健康对照者。
本研究揭示了SSc患者中Th17和Tregs的共存现象及其与疾病活动的相关性。尽管SSc患者外周血中Tregs数量增加，但其抑制功能显著降低。此外，RORC基因的高甲基化与高炎症活动相关，提示表观遗传调控在SSc发病机制中的重要作用。研究结果为未来开发针对Th17和Tregs的SSc治疗策略提供了重要依据。
重要发现
研究首次系统性地揭示了SSc患者中Th17和Tregs的表型、功能及其转录因子甲基化状态与疾病活动的相关性。
方法创新
研究采用了多种先进的实验技术，包括流式细胞术、亚硫酸氢盐焦磷酸测序和实时荧光定量PCR，全面分析了SSc患者的免疫细胞特征。
研究意义
研究结果不仅深化了对SSc发病机制的理解，还为开发新的免疫治疗策略提供了重要线索，特别是针对Th17和Tregs的干预措施。
研究还探讨了SSc患者中其他免疫细胞亚群（如Th1、Th2、Th22）的分布及其与疾病表现的关系，为进一步研究SSc的免疫病理机制提供了参考。此外，研究结果提示，未来研究可重点关注Tregs功能的增强及其表型的稳定化，以期为SSc患者提供更有效的治疗方案。