本研究发表于《Science Immunology》期刊，于2024年5月17日在线发布。主要作者包括Blanda Di Luccia、Martina Molgora、Darya Khantakova等，通讯作者为Martina Molgora和Marco Colonna。研究团队主要来自华盛顿大学圣路易斯医学院病理学与免疫学系，同时包括斯坦福大学、德克萨斯大学MD安德森癌症中心等多个机构的合作者。

一、 学术背景 本研究属于肿瘤免疫学与微生物组学的交叉领域。免疫检查点抑制剂，特别是靶向程序性细胞死亡蛋白1（Programmed Cell Death Protein 1, PD-1）的药物，已成功应用于多种癌症的治疗。然而，大量患者对PD-1单抗治疗无反应或出现复发，因此需要探索提升其疗效的辅助策略。此前研究发现，肿瘤相关巨噬细胞（Tumor-Associated Macrophages, TAMs）通过支持肿瘤细胞存活、促进血管生成和抑制免疫反应等方式削弱了免疫检查点抑制剂的效果。靶向TAMs，例如通过基因敲除或抗体阻断其在髓系细胞上的触发受体2（Triggering Receptor on Myeloid Cells 2, TREM2），可以削弱TAMs的免疫抑制功能并增强抗PD-1疗法诱导的抗肿瘤T细胞反应。另一方面，肠道菌群也被证实与癌症患者对免疫检查点抑制剂的反应密切相关，特定益生菌可以提升治疗效果。

尽管已知TREM2缺失能增强抗PD-1疗效，但其具体机制，特别是肠道菌群是否参与其中，尚不清楚。本研究旨在探索TREM2缺陷如何通过重塑肠道免疫微环境和微生物组，从而远程调控抗PD-1免疫治疗的疗效。研究目标是阐明TREM2、肠道巨噬细胞、特定肠道细菌（瘤胃球菌属）以及抗肿瘤免疫反应之间的复杂相互作用网络。

二、 详细研究流程 本研究设计精密，包含多个相互关联的实验环节，以验证假设并阐明机制。

1. 验证肠道菌群在TREM2缺陷增强抗PD-1疗效中的作用：

   • 研究对象与处理： 使用野生型（Trem2+/+）和TREM2敲除（Trem2-/-）C57BL/6小鼠。为确保母源菌群一致，将不同基因型的孕鼠共笼饲养，并对幼崽进行交叉哺乳。小鼠从出生起共笼饲养，在皮下接种MCA/1956肉瘤细胞后，分为两组：一组继续保持共笼（共笼组，Coh），另一组在接种当天分开饲养（分笼组，Sep）。此外，还设置了从出生起就分开饲养的分笼组（Sep-b）。
   • 实验方法： 所有小鼠接种肿瘤后，从第9天开始接受抗PD-1抗体治疗。监测肿瘤生长，并在特定时间点（如第15天）处死小鼠，通过流式细胞术分析肿瘤内T细胞的频率和亚群。
   • 数据分析： 比较不同饲养条件和基因型下，小鼠肿瘤生长曲线的差异以及肿瘤内免疫细胞浸润的变化。

2. 菌群移植与抗生素干预实验：

   • 菌群移植： 为了直接证明菌群变化是导致疗效差异的原因，研究者进行了盲肠微生物移植。他们收集了分笼饲养的Trem2+/+和Trem2-/-小鼠在肿瘤接种时（菌群-D0）和抗PD-1治疗开始后3天（菌群-D12）的盲肠内容物。将这些内容物通过灌胃方式移植给预先使用万古霉素、新霉素、氨苄青霉素和甲硝唑（VNAM）抗生素鸡尾酒处理了3周的受体小鼠（包括Trem2+/+和Trem2-/-）。移植7天后，受体小鼠接种肿瘤并接受抗PD-1治疗，观察肿瘤生长。
   • 抗生素干预： 为鉴定哪些菌群组分至关重要，研究者在肿瘤接种前和抗PD-1治疗期间，给分笼饲养的Trem2-/-小鼠单独或联合使用不同的抗生素（氨苄青霉素、万古霉素、甲硝唑、新霉素），观察其对肿瘤控制效果的影响。

3. 菌群组成分析：

   • 研究方法： 对上述不同实验组小鼠（Trem2+/+-Sep, Trem2-/–Sep, Trem2+/+-Coh, Trem2-/–Coh）的粪便样本进行V4区16S rRNA基因测序。
   • 数据分析： 使用主坐标分析（Principal Coordinate Analysis, PCoA）评估微生物群落结构的差异。通过指示物种分析（Indicator Species Analysis）和扩增子序列变体（Amplicon Sequence Variants, ASVs）分析，寻找与Trem2-/–Sep组及抗PD-1治疗反应相关的特异性细菌物种。使用置换多元方差分析（PERMANOVA）评估基因型和治疗对菌群结构影响的显著性。

4. 肠道免疫微环境表征：

   • 肠道炎症评估： 通过监测体重变化、粪便脂钙蛋白水平、结肠组织bulk RNA测序以及实时定量PCR检测细胞因子（如TNF， IL-17A, IL-10）表达，评估抗PD-1治疗在Trem2-/-小鼠中是否诱导了肠道炎症。
   • 结肠髓系细胞单细胞RNA测序： 从接种肿瘤并接受或未接受抗PD-1治疗的Trem2+/+-Sep和Trem2-/–Sep小鼠中，分选结肠固有层CD11b+细胞进行单细胞RNA测序。使用Seurat软件包进行聚类分析，根据已知标记基因手动鉴定巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞等亚群，并分析各亚群在不同条件下的丰度变化和基因表达特征。
   • 结肠T细胞分析： 通过流式细胞术分析结肠固有层总CD3+ T细胞、CD4+/CD8+ T细胞亚群、PD-1+ T细胞的频率，并检测细胞内TNF等细胞因子的产生。

5. 肠道T细胞向肿瘤床迁移的追踪：

   • 研究方法： 使用全局表达光转换荧光蛋白Kikume Green-Red（KikGR）的转基因小鼠。这些小鼠在接受来自Trem2+/+-Sep或Trem2-/–Sep供体的菌群-D12移植、接种肿瘤并接受抗PD-1治疗后，通过红外激光照射其肠系膜淋巴结（Mesenteric Lymph Nodes, MLNs），将局部细胞从绿色（KikG+）转换为红色（KikR+）。
   • 数据分析： 在光转换后特定时间点（如第14天），收集肿瘤、肿瘤引流淋巴结（Draining Lymph Nodes, dLNs）、脾脏等组织。通过流式细胞术分选KikR+（来自肠道/MLN）和KikG+（来自其他部位）的T细胞，并检测其细胞因子产生能力。同时定量不同组织中KikR+ T细胞的频率，以评估肠道印记T细胞向肿瘤部位的迁移情况。

6. 特异性益生菌干预实验：

   • 研究方法： 为了直接验证特定细菌的因果作用，研究者对野生型小鼠进行口服灌胃实验。在皮下接种肿瘤并接受抗PD-1治疗的基础上，从第7天或第10天开始，每天给小鼠灌胃活体罗氏菌（Ruminococcus gnavus， 1.5×10^7 CFU/只），持续5-7天，监测肿瘤生长。
   • 对照设置： 设置了灌胃灭活的R. gnavus、灌胃另一种梭菌（Clostridium scindens）或仅灌胃载体的对照组。
   • 免疫分析： 对接受R. gnavus灌胃的小鼠肿瘤组织中的CD45+免疫细胞进行单细胞RNA测序，深入分析肿瘤免疫微环境的改变，特别是巨噬细胞和T细胞亚群的重塑。同时通过流式细胞术验证肿瘤、MLNs和结肠中关键免疫细胞的变化。

三、 主要结果 1. 肠道菌群是TREM2缺陷增强抗PD-1疗效的必要条件： 研究结果显示，当Trem2-/-和Trem2+/+小鼠共笼饲养时，二者对抗PD-1的治疗反应没有差异；而将它们分开饲养后，Trem2-/-小鼠表现出显著增强的肿瘤控制能力和更高的肿瘤内T细胞浸润。这种差异在从出生即分开饲养的小鼠中同样存在。菌群移植实验进一步提供了因果证据：将抗PD-1治疗后的Trem2-/-小鼠菌群移植给野生型小鼠，能使其获得更好的抗肿瘤效果；反之，将野生型小鼠菌群移植给Trem2-/-小鼠，则会削弱其疗效。这表明抗PD-1治疗在Trem2-/-背景下诱导了能促进肿瘤排斥的菌群变化。

1. 罗氏菌的富集与改善的抗PD-1反应相关： 抗生素实验发现，氨苄青霉素和万古霉素会损害Trem2-/-小鼠的抗PD-1疗效，而甲硝唑不影响，暗示某些革兰氏阳性菌是关键。16S测序分析揭示，在分笼饲养的Trem2-/-小鼠中，抗PD-1治疗诱导了独特的菌群结构改变，这种改变在共笼时消失。指示物种分析筛选出10个在Trem2-/–Sep组中特异性富集的ASVs。进一步结合甲硝唑处理（不影响疗效）的数据进行筛选，最终锁定一个与罗氏菌高度匹配的ASV。该菌在Trem2-/–Sep小鼠治疗后的相对丰度显著高于Trem2+/+-Sep小鼠，且其富集发生在抗PD-1治疗之后，表明治疗诱导了其扩增。值得注意的是，使用抗TREM2抗体进行急性阻断虽也能增强疗效，但未观察到R. gnavus的富集，提示可能存在其他具有相似功能的菌种。

2. TREM2缺陷联合抗PD-1诱导肠道亚临床炎症和促炎巨噬细胞极化： 尽管未观察到明显的结肠炎临床症状，但结肠组织RNA测序显示，抗PD-1治疗的Trem2-/-小鼠结肠中，与细胞激活、免疫粘附、T细胞激活和抗原呈递相关的通路富集，促炎细胞因子TNF和IL-17A的转录水平升高，而抗炎因子IL-10降低。单细胞RNA测序分析结肠CD11b+细胞发现，抗PD-1治疗的Trem2-/-小鼠结肠中，具有免疫刺激和炎症特征的巨噬细胞（如表达CCL3， CCL4， IL1B， NLRP3的亚群）有所增加，而具有免疫抑制特征的巨噬细胞（表达MRC1， CD163， FCRLS等）略有减少。同时，结肠固有层中总CD3+ T细胞和产生TNF的CD4+ T细胞频率也升高。

3. 源自TREM2缺陷小鼠的菌群促进肠道T细胞向肿瘤床迁移： 使用KikGR小鼠的追踪实验证明，接受Trem2-/–Sep来源菌群移植的小鼠，其肿瘤引流淋巴结中来自肠道/MLN的KikR+ CD4+ T细胞能够产生更多的TNF。并且，这些小鼠的肿瘤引流淋巴结中，无论是KikR+还是总KikG+ T细胞的频率都更高，表明移植的菌群不仅能促进肠道T细胞的迁移，还可能系统性增强了T细胞向肿瘤部位的招募或局部扩增。

4. 口服罗氏菌能直接增强抗PD-1的肿瘤疗效并重塑肿瘤免疫微环境： 对野生型小鼠直接灌胃活体R. gnavus（而非灭活菌或对照菌），能显著增强抗PD-1的疗效，成功模拟了TREM2缺失的效果。单细胞RNA测序分析显示，R. gnavus处理导致肿瘤内免疫景观发生深刻重塑：所有αβ TCR CD4+和CD8+ T细胞亚群（包括活化和静息状态）的频率均增加，而调节性T细胞保持不变。在巨噬细胞区室中，高表达TREM2、CX3CR1、SPP1等免疫抑制分子的巨噬细胞亚群减少，而表达CCL5等炎症分子的巨噬细胞亚群增加。流式细胞术进一步证实，R. gnavus处理增加了肿瘤中MHC II+巨噬细胞、MLNs中迁移型常规树突状细胞和总T细胞，以及结肠中活化T细胞的浸润。

四、 结论与意义 本研究得出结论：TREM2缺陷通过重塑肠道免疫微环境和微生物组，远程调控抗PD-1免疫治疗的疗效。其机制在于，抗PD-1治疗在TREM2缺陷的背景下，诱导了结肠巨噬细胞向促炎表型极化，并导致罗氏菌在肠道中富集。这种改变创造了一个亚临床炎症环境，促进了产生TNF的CD4+ T细胞的扩增、循环和向远端肿瘤床的迁移，从而增强了抗肿瘤免疫反应。更重要的是，直接补充罗氏菌足以在野生型小鼠中模拟这一增强效应，使其成为一种潜在的益生菌制剂，用于提高癌症患者对PD-1抑制剂的反应率。

本研究具有重要的科学价值和应用前景。在科学上，它首次揭示了TREM2作为一个关键节点，整合了肿瘤局部（TAMs）、肠道局部（巨噬细胞、菌群）和系统免疫（T细胞迁移），共同影响免疫治疗疗效的完整环路，深化了对免疫检查点抑制剂作用机制的理解。在应用上，研究不仅为靶向TREM2的联合疗法提供了新的理论依据，更重要的是，它鉴定出罗氏菌作为一种具有明确抗肿瘤免疫增强潜力的益生菌，为开发基于微生物组的癌症辅助治疗策略（如益生菌配方、菌群移植）提供了直接且有力的候选靶标。这为克服当前免疫治疗耐药性问题开辟了新的、极具潜力的方向。

五、 研究亮点 1. 创新的机制发现： 突破了传统上关注肿瘤局部TAMs功能的局限，首次系统阐明了TREM2通过调控“肠道菌群-肠道免疫-系统免疫”轴来远程影响抗PD-1疗效的完整机制，体现了跨器官免疫调控的新范式。 2. 严谨的因果论证链： 研究设计环环相扣，综合运用了遗传学模型（基因敲除）、菌群操控（共笼/分笼、抗生素、菌群移植）、细胞追踪（光转换技术）和益生菌干预等多种手段，从相关性到因果性，层层递进地验证了核心假设。 3. 高分辨率的解析技术： 广泛应用单细胞RNA测序技术，在单细胞水平上精细解析了结肠巨噬细胞和肿瘤浸润免疫细胞的异质性及其在干预下的动态变化，为机制阐释提供了详实的数据支撑。 4. 显著的转化潜力： 不仅停留在机制探索，更通过直接灌胃实验验证了罗氏菌的治疗潜力，将基础研究发现直接指向了潜在的临床干预策略，转化路径清晰。 5. 精细的实验控制： 通过交叉哺乳、控制饮食、详细定义饲养条件等，最大限度地减少了菌群研究中的混杂因素，确保了结果的可靠性。