学术研究报告：Stereo-Cell——基于高密度DNA纳米球图案化阵列的空间增强分辨率单细胞测序平台

一、 作者与发表信息

本研究由来自中国多家科研机构的庞大团队共同完成。主要通讯作者为Longqi Liu (liulongqi@genomics.cn)、Ao Chen (chenao@genomics.cn) 和 Xun Xu (xuxun@genomics.cn)。第一作者及同等贡献作者包括 Sha Liao、Xiaoxi Zhou、Chuanyu Liu、Chang Liu、Shijie Hao、Hongyu Luo 等。研究团队主要依托BGI Research（华大研究院）在深圳、杭州、重庆等多个地点的实验室，并联合了浙江大学、中国科学院大学、山西医科大学、复旦大学、香港中文大学等多所高校及附属医院。

该研究成果以题为《Stereo-Cell: Spatial enhanced-resolution single-cell sequencing with high-density DNA nanoball–patterned arrays》的研究长文形式，于 2025年8月21日 发表在顶级学术期刊 《Science》 上，卷号为第389卷，文章电子识别码为 eadr0475，DOI为 10.1126/science.adr0475。

二、 学术背景与研究目的

本研究属于单细胞组学技术领域，特别是单细胞转录组测序技术的创新与开发。单细胞测序技术在过去十年中极大地推动了我们对细胞异质性和功能多样性的理解。然而，现有主流技术，无论是基于微孔板的Smart-seq2（高灵敏度但通量低），还是基于微滴包裹的10x Genomics平台（高通量但存在通量上限和细胞尺寸限制），或是单细胞组合索引策略，均面临一些固有的权衡与技术局限。这些局限主要体现在：1) 在通量、灵敏度和细胞类型兼容性之间的取舍；2) 捕获均一性不足可能导致细胞类型比例偏差；3) 对超大细胞（如卵母细胞、多核肌纤维）、细胞外囊泡及微结构的兼容性差；4) 难以与空间定位信息、细胞成像、多组学（如蛋白质组）无缝整合，从而限制了对原位细胞微环境、细胞间相互作用和亚细胞转录本定位的研究。

基于此背景，研究团队提出科学假设：利用其先前开发的空间增强分辨率组学测序（Stereo-seq） 技术所依赖的核心——高密度DNA纳米球图案化阵列 平面芯片，凭借其纳米级分辨率和可扩展的视场，无需物理分隔封装，即可实现原位转录本捕获。这种设计有望支持从微小细胞到大型细胞、细胞外囊泡及微结构的直接分析。研究的目标是开发并验证一个名为 “Stereo-Cell” 的新型单细胞测序平台。该平台旨在突破现有技术的瓶颈，实现从极低（约200个）到超高（近百万个）输入细胞数范围内的可扩展、无偏倚的细胞捕获，并同时整合高保真转录组分析、多重荧光成像、细胞表面蛋白多组学分析，最终形成一个能够解析细胞相互作用、微环境和亚细胞基因表达谱的综合性框架。

三、 详细研究流程与方法

Stereo-Cell平台的核心是高密度DNA纳米球图案化阵列芯片（DNB芯片）。DNA纳米球直径约220纳米，中心间距500纳米，密集排布于芯片表面，每个DNB上带有独特的空间坐标条形码（Coordinate ID）和分子条形码（Molecular ID），以及用于捕获mRNA 3‘端poly(A)尾巴的寡聚dT探针。

详细工作流程如下：

1. 芯片预处理与细胞加载：首先，在DNB芯片表面包被聚赖氨酸（Poly-L-Lysine），通过增强细胞膜（带负电）与芯片表面之间的静电相互作用，促进悬浮细胞的粘附。然后，将制备好的单细胞悬液（研究对象包括：人源HEK293T和小鼠NIH-3T3细胞混合样本、人外周血单个核细胞、NIH-3T3成纤维细胞、小鼠骨骼肌肌纤维、小鼠卵母细胞等）滴加到芯片指定区域。芯片根据尺寸分为S0.5 (0.5x0.5 cm)、S1 (1x1 cm)、S3 (3x3 cm)、S6 (6x6 cm) 等多种规格，以适配不同细胞通量需求（从200个到近100万个细胞）。

2. 细胞固定、染色与成像：细胞附着后，进行固定、透化处理。随后，进行多重荧光染色和成像。这是Stereo-Cell的关键优势环节。研究中使用4‘,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI） 进行核染色，使用1,1’-二十八烷基-3,3,3’,3‘-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐（DiI） 进行膜染色，以及使用小麦胚芽凝集素（WGA） 偶联物标记细胞膜。更重要的是，平台整合了多重免疫荧光 和 CITE-seq 技术。对于CITE-seq，将带有寡核苷酸条形码的抗体与细胞孵育，使抗体结合在细胞表面蛋白上。这些染色和抗体信号在芯片上进行多轮荧光成像，获取每个细胞的形态学、核数量及蛋白质表达的空间信息。

3. 原位逆转录与cDNA合成：在透化的细胞上，进行原位逆转录。细胞内的mRNA以及CITE-seq抗体的寡核苷酸标签（二者均具有poly(A)尾巴）与DNB芯片上的oligo-dT探针杂交并被捕获。随后进行逆转录，生成带有空间坐标和分子条形码信息的cDNA。

4. cDNA释放、扩增与测序文库构建：完成逆转录后，将cDNA从芯片上释放、收集并进行PCR扩增。随后，分别构建用于转录组分析的cDNA文库和用于蛋白组分析的抗体衍生标签文库。最后进行高通量测序。

5. 数据分析流程：

   • 空间表达矩阵生成：测序数据经过比对和处理，生成包含每个转录本空间坐标（X, Y）和基因信息的表达矩阵。
   • 基于深度学习的细胞分割：这是处理的关键步骤。研究团队开发了基于深度学习（如U-Net++） 的细胞分割算法。将基因表达数据转换为灰度图像，利用算法根据转录本信号的空间聚集模式，自动识别和分割出单个细胞的边界。
   • 基于成像的双联体剔除：利用前期获取的DAPI等染色成像数据，识别那些被分割为一个区域但内部包含多个细胞核的“双联体”或“多联体”，并将其从后续单细胞分析中排除。此方法能将双联体率显著降低（例如从4.38%降至1.23%），并能识别同型双联体（即两个相同类型的细胞粘连，这是传统计算方法难以区分的）。
   • 单细胞表达谱分析与整合：获得高质量的单细胞表达矩阵后，进行标准的单细胞转录组数据分析，包括质量控制、标准化、降维（如UMAP）、聚类、细胞类型注释、差异表达分析、拟时序分析等。对于CITE-seq数据，将RNA表达谱与抗体蛋白信号（ADT）进行整合分析，构建多组学图谱。
   • 空间基因模块与相互作用分析：利用芯片提供的空间坐标，对如肌纤维、卵母细胞等大型样本，进行空间基因共表达模块分析（使用Hotspot算法），识别具有特定空间分布模式的基因簇。对于培养的细胞，分析细胞簇之间的空间邻近关系，以推断细胞间相互作用和微环境特征。
   • 算法与工具：除了自定义的细胞分割流程，研究还使用了多种生物信息学工具进行验证和分析，如scDblFinder用于计算双联体、Seurat用于单细胞分析、Monocle 3用于拟时序分析、SCENIC用于转录因子调控网络推断、SEVtras用于细胞外囊泡识别等。

四、 主要研究结果

研究通过一系列严谨的实验，全面验证了Stereo-Cell平台的性能、优势和应用潜力。

1. 高通量、高准确性及宽输入范围验证： * 基本性能：使用人鼠混合细胞系（HEK293T/NIH-3T3）验证。结果显示，转录本信号与DAPI核染色高度共定位，深度学习分割准确，单个细胞内可捕获中位数约10，000个独特分子标识符和超过3，000个基因。通过计算发现，大部分转录本（~68%）集中在很小的芯片面积（~5.6%）内，证明了基于RNA信号的细胞分割准确性。 * 双联体剔除：成像辅助的双联体剔除方法有效降低了双联体率，并去除了同型双联体，确保了单细胞数据的纯度。 * 输入范围灵活性：实验证实，Stereo-Cell可以稳定处理从200个到近100万个（使用S6芯片）的细胞输入，且在不同输入量下均能保持较低的成像后双联体率和良好的细胞回收能力。

2. 与主流技术的基准比较及稀有细胞检测： * 与人PBMCs的基准测试：使用人外周血单个核细胞（PBMCs）进行测试，并与公开的10x Chromium数据整合比较。结果表明，Stereo-Cell产生的基因表达谱与10x数据高度一致。更重要的是，在细胞类型比例上，Stereo-Cell检测到的单核细胞、T细胞、B细胞等主要亚群的比例，与流式细胞术的“金标准”结果更为接近，而10x数据则显示出对单核细胞的过度捕获偏差（28.31% vs. 流式的17.1%），表明Stereo-Cell具有更无偏倚的细胞捕获能力。 * 超高通量与稀有细胞鉴定：使用更大尺寸的S3和S6芯片，成功对25万和90万个PBMCs进行测序，不仅保持了高转录本检测效率，还因数据量的增加实现了更高分辨率的细胞分类，并成功鉴定出比例极低（约0.05%）的人造血干细胞和祖细胞群体，展示了其在稀有细胞研究中的潜力。

3. 多模态与多组学整合能力： * 整合多重免疫荧光：成功在PBMCs样本上同时进行转录组测序和针对CD3、CD45RA蛋白的免疫荧光成像。蛋白信号的空间分布与基于转录组注释的细胞类型完全吻合，且成像过程未对转录本捕获效率造成明显影响。 * 开发Stereo-Cell-CITE：将CITE-seq技术整合到平台中，实现了单细胞分辨率下转录组与154种表面蛋白的同步检测。在PBMCs的刺激（PMA/离子霉素）实验中，多组学数据提供了更精细的细胞分型，例如识别出仅凭RNA数据难以分辨的CD112+ T细胞亚群和CD103+组织驻留免疫细胞。刺激前后对比分析揭示了细胞比例变化、关键蛋白（如CD62L、CD16）的下调，并构建了刺激特异性蛋白-基因共表达网络，突出了KLDR1（CD94）等节点在免疫调节中的核心作用。

4. 原位细胞培养与微环境分析： * 芯片培养兼容性：验证了细胞在DNB芯片上长期培养（64小时）的可行性，且芯片底物不影响细胞基因表达。 * 原位转录组捕获优势：与消化后捕获的悬浮细胞相比，直接在芯片上培养并进行原位捕获的NIH-3T3成纤维细胞，高表达了与细胞外基质组织、细胞迁移和细胞-基质粘附相关的基因，而悬浮细胞则高表达凋亡相关基因，证明原位捕获能保留细胞与微环境相互作用的真实状态。 * 鉴定细胞外囊泡：在原位培养的细胞数据中，通过聚类发现了一类基因数少、转录本信号聚集在细胞突起附近的小结构。这些结构高表达细胞外囊泡相关基因（如GPHN、COPS2），并被SEVtras算法及针对囊泡标记物（Syn）和负标（Calnexin）的免疫荧光实验确认为细胞外囊泡。这表明Stereo-Cell能够捕获和研究细胞释放的膜性结构。 * 细胞对刺激的反应与相互作用：对LPS刺激的成纤维细胞进行分析，发现TGF-β信号通路激活，并鉴定出与纤维化激活相关的细胞亚群（高表达BNC2、SOX9）。空间分析显示这些细胞倾向于聚集，且与其他细胞簇的相互作用在刺激后增强，揭示了细胞微环境在应激响应中的动态变化。

5. 大型与复杂结构样本分析： * 多核骨骼肌肌纤维：成功捕获并测序了从小鼠比目鱼肌和趾长伸肌分离的完整肌纤维。通过结合核染色成像和k-means空间分箱（ROI）分析，不仅区分了快肌、慢肌等不同类型，还在单根肌纤维内部识别出具有空间特异性的功能区域。例如，在趾长伸肌肌纤维中，Col22a1 高表达区域富集于两端（对应肌腱连接处），Chrna1 高表达区域位于中部（对应神经肌肉接头处），Myh1 和 Myh4 也呈现出不同的空间分布模式。这些结果通过RNAscope原位杂交得到了验证。空间基因模块分析进一步系统性地解析了肌纤维内部的空间异质性。 * 大型细胞——小鼠卵母细胞：成功对719个小鼠卵母细胞进行了高通量测序，平均每个卵母细胞检测到近9000个基因。聚类分析准确识别出生长、生发泡、生发泡破裂和减数分裂等不同发育阶段。拟时序分析和SCENIC调控网络推断揭示了Wnt、TGF-β等信号通路及关键转录因子在卵母细胞成熟过程中的动态调控。核染色显示了伴随发育的染色质形态变化。更重要的是，利用纳米级分辨率，在单个卵母细胞内部识别出具有聚集模式和分散模式的空间基因模块，例如Ooep 基因呈聚集分布，Slc45a3 基因呈分散分布，并通过单分子RNA荧光原位杂交实验得到了直接验证，实现了对大型细胞亚细胞转录本定位的探索。

五、 结论与价值

本研究成功开发并验证了 Stereo-Cell，一个基于高密度DNA纳米球图案化阵列的、革命性的单细胞多模态测序平台。该研究的主要结论是：Stereo-Cell建立了一个集高通量、无偏倚单细胞转录组分析、空间分辨率、多组学整合和成像兼容性于一体的综合性框架。它有效克服了现有单细胞测序方法在通量扩展性、细胞尺寸/类型兼容性、捕获偏差以及多模态信息整合等方面的核心限制。

其科学价值和应用价值体现在多个层面：1) 技术突破：提供了一种不依赖物理封装的原位捕获新范式，为单细胞技术发展开辟了新方向。2) 基础研究赋能：使研究者能够以前所未有的规模和精度，研究从稀有免疫细胞到大型特殊细胞的异质性，解析原位细胞微环境、细胞间通讯和亚细胞分子空间组织，这对发育生物学、神经科学、肿瘤免疫学等领域至关重要。3) 临床转化潜力：其低输入兼容性适合珍贵临床活检样本，超高通量能力有助于在循环肿瘤细胞检测等液体活检中寻找稀有事件，多模态整合能力则能更全面地表征疾病状态，助力精准医疗。4) 方法论贡献：开发了结合深度学习和成像的细胞分割与质控流程，为空间单细胞数据分析提供了新工具。

六、 研究亮点

1. 原理创新：首次将高密度平面DNB阵列技术系统地应用于单细胞（而非组织切片）的分离式分析，实现了“封装自由”的单细胞测序。
2. 性能卓越：在一个平台上同时实现了超宽细胞输入范围、高捕获效率、无偏倚的细胞类型比例还原、以及对超大细胞/复杂结构的兼容性，这在现有技术中难以兼得。
3. 深度融合多模态：无缝、原生地整合了单细胞转录组、空间定位、多重荧光成像（形态、蛋白）和表面蛋白组学，提供了前所未有的多维单细胞数据。
4. 应用拓展性强：研究通过涵盖免疫细胞、培养细胞、细胞外囊泡、多核肌纤维和卵母细胞等多种挑战性样本，全面展示了平台在免疫学、细胞生物学、发育生物学、肌肉生物学等广泛领域的强大应用潜力。
5. 方法学严谨：不仅展示了新平台，还通过大量与金标准技术（流式、RNA-FISH、RNAscope、公共数据集）的对比实验，严谨验证了其数据的准确性和优越性。

七、 其他有价值的内容

文章也坦诚指出了Stereo-Cell当前面临的挑战与未来改进方向：1) 芯片制造和数据分析流程相比成熟的商业化平台更为复杂，需要进一步的工艺和算法优化以实现自动化与易用性；2) 无封装设计可能导致一定程度的RNA横向扩散，虽然在优化细胞密度下影响甚微，但未来可通过改进透化化学和捕获动力学来进一步抑制；3) 在极低细胞输入下，文库复杂度降低可能影响转录本检测，需要优化测序深度或引入背景消除策略；4) 目前主要捕获转录组和蛋白质组，尚无法同时捕获基因组DNA等其他组分信息。这些挑战也为该技术的后续发展指明了方向。总体而言，Stereo-Cell代表了单细胞分析技术迈向更全面、更集成、更贴近生物学原位状态的重要一步。