连翘苷A通过调节PPAR-γ/RXR-α复合体，抑制急性肺损伤中的肺-结肠炎症及上皮屏障损伤
本研究的通讯作者为Cheng Peng与Yunxia Li，来自成都中医药大学药学院暨西南特色中药资源国家重点实验室。研究论文《Forsythiaside a alleviates acute lung injury by inhibiting inflammation and epithelial barrier damages in lung and colon through PPAR-γ/RXR-α complex》发表于Elsevier旗下期刊Journal of Advanced Research（第60卷，2024年）。研究于2023年4月20日收到稿件，历经修改后于2023年8月9日被接受，并于2023年8月12日在线发表。
本研究隶属于医学与药理学交叉领域，具体聚焦于急性肺损伤（Acute Lung Injury, ALI）的发病机制及中药活性成分的干预治疗。ALI及其严重形式急性呼吸窘迫综合征（ARDS）是以弥漫性炎症细胞浸润、出血和肺水肿为特征的肺部疾病，炎症是其中的关键致病环节。当前，除机械通气外，糖皮质激素等药物干预仍是主要治疗手段，但存在多种不良反应。因此，亟需开发新的治疗策略和药物。
近年来，肠-肺轴（gut-lung axis）理论的兴起揭示了肠道与肺部之间通过黏膜免疫和系统循环相互影响的密切联系。研究表明，肺部或肠道发生损伤时，病原体或内毒素（如脂多糖，LPS）可穿过受损的上皮屏障进入循环系统，触发局部及远端的级联炎症反应。上皮屏障是维持肺和肠道结构稳定与免疫稳态的重要组成部分，由粘附连接蛋白（如E-cadherin）和紧密连接蛋白（如ZO-1， Claudin-1）构成。炎症被认为是破坏肺和肠道上皮屏障的重要因素。因此，抑制炎症和上皮屏障损伤，基于肠-肺轴进行治疗，可能是治疗ALI的有效途径。
连翘是治疗肺部疾病的常用中药。本研究团队前期工作发现，连翘提取物可通过调节过氧化物酶体增殖物激活受体γ（Peroxisome proliferator-activated receptor gamma， PPAR-γ）及其结合蛋白视黄醇X受体α（Retinoid X receptor alpha， RXR-α）复合体的活性，预防LPS诱导的ALI小鼠肺和结肠组织的炎症和上皮屏障损伤。然而，连翘中具体是哪种活性成分通过肠-肺轴发挥治疗ALI的作用尚不明确。连翘苷A（Forsythiaside A）是连翘的主要活性成分，已有研究表明其对LPS诱导的ALI具有显著疗效，例如通过抑制TLR4/NF-κB信号通路或上调microRNA-124来减轻炎症。因此，连翘苷A有潜力作为连翘治疗ALI的活性物质进行深入研究。
基于以上背景，本研究旨在以肠-肺轴为理论基础，运用体内外模型，系统研究连翘苷A治疗ALI的疗效及其机制，重点关注其对肺和结肠组织炎症及上皮屏障损伤的改善作用，并深入探讨其作用是否与调控关键的核转录因子PPAR-γ及其结合蛋白RXR-α有关。
本研究采用了从整体动物到细胞模型的系统研究策略，共包含两大部分：体内实验和体外实验。整体工作流程严谨，层层递进。
第一部分：体内实验研究连翘苷A对LPS诱导的ALI小鼠的影响 1. 动物模型构建与分组给药：研究使用雄性ICR小鼠（SPF级，5-6周龄）。将48只小鼠随机分为6组（每组8只）：对照组、模型组、地塞米松阳性药组以及连翘苷A低、中、高剂量组。除对照组外，其余各组小鼠通过气管滴注LPS（5 mg/kg）建立ALI模型。在LPS建模前1小时、建模后24小时和48小时，各给药组小鼠分别灌胃给予相应剂量的连翘苷A（20， 40， 80 mg/kg）或地塞米松（5 mg/kg）。建模72小时后，采集小鼠血清、肺组织和结肠组织用于后续分析。 2. 疗效评价指标检测： * 宏观指标：测量小鼠体重、肺湿重，计算肺指数（肺重/体重）。 * 组织病理学分析：取右肺和结肠段进行石蜡包埋、切片，进行苏木精-伊红染色，观察组织炎症浸润和结构损伤情况，并对肺组织炎症进行半定量评分。 * 血清内毒素检测：使用鲎试剂盒测定小鼠血清中的内毒素/LPS水平。 * 蛋白表达分析： * 免疫组化：检测肺和结肠组织中巨噬细胞标志物F4/80以及上皮屏障蛋白E-cadherin， ZO-1， Claudin-1的表达与分布。 * Western Blot：检测肺和结肠组织中多种蛋白的表达水平。包括： * 炎症指标：诱导型一氧化氮合酶（iNOS）， 肿瘤坏死因子-α（TNF-α）， 白细胞介素-1β（IL-1β）， IL-6。 * 信号通路蛋白：TLR4/MyD88/NF-κB通路相关蛋白（TLR4， MyD88， IKK-β， p-IκB-α/IκB-α， p-p65/p65）和MAPK通路蛋白（p-p38/p38， p-JNK/JNK， p-ERK/ERK）；MLCK/MLC2通路蛋白（p-MLCK/MLCK， p-MLC2/MLC2）。 * 靶点蛋白：PPAR-γ/RXR-α复合体相关蛋白（PPAR-γ， p-PPAR-γ， RXR-α， p-RXR-α）。
第二部分：体外实验研究连翘苷A对细胞模型的作用机制 1. 细胞模型建立与药物处理：研究构建了三种细胞损伤模型： * 巨噬细胞模型：使用小鼠单核巨噬细胞RAW264.7， 以LPS（1 μg/mL）刺激诱导炎症。 * 肺上皮细胞模型：使用人肺泡上皮细胞A549， 以TNF-α（100 ng/mL）刺激诱导炎症和上皮屏障损伤。 * 结肠上皮细胞模型：使用人结肠上皮细胞SW620， 以TNF-α（50 ng/mL）刺激诱导炎症和上皮屏障损伤。 通过MTT法确定连翘苷A对各细胞的安全浓度范围及LPS/TNF-α的建模浓度，并设置相应的低、中、高给药剂量组进行干预。 2. 细胞表型与机制探究： * 细胞形态观察：使用倒置显微镜观察药物处理后细胞形态的变化。 * 炎症因子检测：使用ELISA法检测细胞培养上清液中TNF-α， IL-1β， IL-6等促炎细胞因子的水平。使用Western Blot检测细胞内相关炎症蛋白的表达。 * 上皮屏障蛋白检测：使用Western Blot检测A549和SW620细胞中E-cadherin， ZO-1， Claudin-1的表达。 * 信号通路验证：使用Western Blot检测各细胞模型中TLR4/MAPK/NF-κB通路（RAW264.7）或NF-κB/MLCK/MLC2通路（A549， SW620）相关蛋白的表达变化。 * PPAR-γ/RXR-α复合体活性与互作研究： * 蛋白活性：使用Western Blot检测连翘苷A对各细胞中PPAR-γ， p-PPAR-γ， RXR-α， p-RXR-α蛋白表达的影响。 * 蛋白相互作用：使用免疫共沉淀技术，以RXR-α抗体下拉PPAR-γ/RXR-α复合体，再通过Western Blot检测PPAR-γ， 以此分析连翘苷A对PPAR-γ与RXR-α之间蛋白-蛋白相互作用的影响。 * 靶点干预验证：为了确证连翘苷A的作用依赖于PPAR-γ/RXR-α复合体，研究使用了RXR-α的特异性抑制剂UVI3003。预先确定UVI3003在各细胞中的适宜干预浓度，然后在连翘苷A（高剂量）处理的同时加入UVI3003，观察其对连翘苷A疗效的阻断作用。通过Western Blot和ELISA检测干预后PPAR-γ活性、下游信号通路蛋白以及炎症/上皮屏障指标的变化。
数据分析：所有数据均以均值±标准差表示。使用SPSS软件进行单因素方差分析或非参数检验，以P < 0.05为差异具有统计学意义。
体内实验结果： 1. 连翘苷A减轻ALI小鼠肺和结肠的炎症：与模型组相比，连翘苷A（尤其是中、高剂量）能显著降低ALI小鼠的肺湿重和肺指数，改善肺组织肺泡结构破坏和炎症细胞浸润，降低肺组织炎症评分。Western Blot和免疫组化结果显示，连翘苷A能显著抑制肺和结肠组织中iNOS， TNF-α， IL-1β， IL-6等炎症指标的表达，并减少组织中巨噬细胞（F4/80阳性）的浸润。这些结果证实连翘苷A对LPS诱导的全身性炎症，特别是肺和结肠部位的炎症，具有明确的抑制作用。 2. 连翘苷A保护ALI小鼠肺和结肠的上皮屏障：模型组小鼠肺和结肠组织中上皮屏障蛋白（E-cadherin， ZO-1， Claudin-1）的表达显著降低，血清内毒素水平显著升高，表明上皮屏障受损。连翘苷A治疗能显著逆转这些蛋白的表达下调，并降低血清内毒素水平。这说明连翘苷A能够减轻炎症导致的肺和结肠上皮屏障功能损伤。 3. 连翘苷A抑制TLR4/MAPK/NF-κB和MLCK/MLC2信号通路：在ALI小鼠的肺和结肠组织中，TLR4/MAPK/NF-κB通路和下游的NF-κB/MLCK/MLC2通路被显著激活。连翘苷A处理能显著抑制这些通路关键蛋白（如TLR4， p-p65， p-MLCK等）的过度表达。这初步揭示了连翘苷A抗炎和保护屏障的作用机制。 4. 连翘苷A对肺和结肠组织PPAR-γ/RXR-α表达具有双向调节作用：一个有趣的发现是，LPS引起小鼠肺组织中PPAR-γ/RXR-α蛋白表达下降，却引起结肠组织中该复合体表达上升。而连翘苷A能够增加肺组织中的PPAR-γ/RXR-α表达，同时抑制结肠组织中该复合体的过度表达。这提示连翘苷A的作用可能具有组织特异性。
体外实验结果： 1. 连翘苷A抑制巨噬细胞炎症：在LPS诱导的RAW264.7细胞中，连翘苷A能抑制细胞形态向激活态转变，降低上清中TNF-α和IL-6的水平及细胞内iNOS， TNF-α的表达，并抑制TLR4/MAPK/NF-κB通路的激活。 2. 连翘苷A抑制肺和结肠上皮细胞的炎症与屏障损伤：在TNF-α诱导的A549和SW620细胞中，连翘苷A能改善细胞形态异常，降低促炎因子（TNF-α， IL-1β， IL-6）的表达，上调上皮屏障蛋白（ZO-1等）的表达，并抑制NF-κB/MLCK/MLC2信号通路的激活。 3. 连翘苷A以细胞特异性方式调控PPAR-γ/RXR-α复合体：这是本研究最核心的机制发现。 * 蛋白表达：LPS降低RAW264.7细胞中RXR-α表达但增加PPAR-γ磷酸化；TNF-α降低A549细胞中p-PPAR-γ和RXR-α表达，却增加SW620细胞中PPAR-γ及其磷酸化水平。连翘苷A能逆转这些异常变化。 * 蛋白互作：Co-IP实验显示，LPS减弱了RAW264.7细胞中PPAR-γ与RXR-α的相互作用；TNF-α减弱了A549细胞中两者的相互作用，但增强了SW620细胞中两者的相互作用。连翘苷A能够促进RAW264.7和A549细胞中PPAR-γ/RXR-α的相互作用，而抑制SW620细胞中过强的相互作用。 4. 靶点验证确认PPAR-γ/RXR-α介导连翘苷A的疗效：使用RXR-α抑制剂UVI3003干扰PPAR-γ/RXR-α复合体的形成后，连翘苷A在RAW264.7和A549细胞中促进PPAR-γ活性、抑制下游炎症通路及炎症指标的作用被削弱；在SW620细胞中，UVI3003虽然增强了连翘苷A对PPAR-γ/RXR-α互作的抑制，但并未进一步影响其抗炎和保护屏障的效果，这可能提示在SW620细胞中存在更复杂的调控网络。尽管如此，该实验强有力地证明，连翘苷A对炎症和屏障损伤的抑制作用，至少部分是通过调节PPAR-γ/RXR-α复合体的活性来实现的，且其调节模式具有细胞类型特异性。
结论：本研究首次基于肠-肺轴理论，系统阐明了中药连翘活性成分连翘苷A治疗急性肺损伤的多靶点作用机制。连翘苷A能够通过调节PPAR-γ/RXR-α核受体复合体的活性（在不同细胞中表现为促进或抑制其相互作用），进而抑制TLR4/MAPK/NF-κB和NF-κB/MLCK/MLC2信号通路，最终减轻巨噬细胞、肺上皮细胞和结肠上皮细胞的炎症反应及上皮屏障损伤，从而在整体动物水平上缓解LPS诱导的ALI。
科学价值： 1. 深化了对连翘苷A药效机制的认识：将连翘苷A的抗ALI作用从传统的抑制TLR4/NF-κB通路，拓展到基于肠-肺轴的整体调节，并首次将其核心作用靶点锁定为PPAR-γ/RXR-α复合体。 2. 揭示了PPAR-γ免疫调节作用的复杂性：研究结果生动地展示了PPAR-γ/RXR-α复合体在炎症调控中具有细胞和组织特异性。同一化合物在不同细胞（巨噬细胞、肺上皮细胞、结肠上皮细胞）中对该复合体产生截然不同的调节方向（促进或抑制互作），但最终都导向抗炎和保护屏障的相同疗效。这为理解核受体功能的上下文依赖性提供了重要实例。 3. 为基于肠-肺轴的药物研发提供了新思路：证实了同时靶向肺和肠道、保护上皮屏障是治疗ALI的有效策略，连翘苷A可作为先导化合物进行深入研究。
应用价值：该研究为开发治疗ALI/ARDS的中药创新药物提供了坚实的药理学依据和明确的分子靶点。连翘苷A有望被进一步开发为通过多靶点、多器官协同起抗炎作用的候选药物。
研究中观察到的连翘苷A对IL-1β表达的调节在不同模型中结果不一致（在体内组织和部分细胞中抑制其表达，但在LPS诱导的RAW264.7细胞中反而增加其表达），作者指出这可能与IL-1β还参与细胞凋亡和自噬等过程有关。这一细节提示了炎症网络的复杂性，也表明连翘苷A可能存在除经典炎症通路外的其他作用途径，值得未来进一步探索。此外，论文的图形摘要清晰地概括了全文的核心发现，即连翘苷A通过细胞特异性调节PPAR-γ/RXR-α复合体，抑制下游信号通路，从而在肠-肺轴上发挥抗ALI作用。