本研究于2023年发表在学术期刊《Cell Proliferation》上，题为“Piezo1-mediated M2 macrophage mechanotransduction enhances bone formation through secretion and activation of transforming growth factor-β1”。研究的主要作者为蔡光辉、鲁亚辉、钟伟杰（三人为共同贡献者）、王婷、李颖艺、阮小磊、陈红玉、孙莲、管兆兰、李根、张恒伟、孙文、陈明龙、张卫兵和王华。通讯作者为王华与张卫兵，所属机构包括南京医科大学附属口腔医院正畸科、江苏省口腔疾病研究重点实验室、苏州大学独墅湖医院口腔科、苏州大学医学中心口腔科、美国罗切斯特大学医学中心病理学与实验室医学系、南京医科大学第一附属医院心内科以及江苏省口腔转化医学工程研究中心。
该研究的科学领域为骨生物学、免疫学与生物力学的交叉领域，属于骨免疫机制研究。骨骼是一个动态组织，其稳态和修复高度依赖于力学刺激。巨噬细胞作为关键的免疫细胞，具有感知微环境并极化为不同表型（促炎M1型或修复性M2型）的能力，在组织修复中扮演核心角色。然而，机械力如何被免疫系统（特别是巨噬细胞）感知，并进而调控骨形成的具体分子机制尚不清楚。Piezo1是一种非选择性阳离子通道，广泛表达于多种组织，被认为是关键的机械力感受器。尽管有研究提示Piezo1与炎症反应相关，但其在巨噬细胞介导的力-骨形成耦合中的作用，以及下游的具体信号通路仍是未解之谜。因此，本研究旨在探究机械张力是否以及如何通过Piezo1通道调控巨噬细胞表型转化，并阐明这种转化如何通过分泌特定因子（如转化生长因子-β1， TGF-β1）来促进骨髓间充质干细胞（BMSCs）的成骨分化，最终影响骨形成。研究目标明确，即揭示一条从机械力感知（Piezo1）到免疫细胞响应（巨噬细胞M2极化），再到干细胞命运决定（BMSCs成骨）的完整信号传导通路。
研究的工作流程系统而详尽，分为体外细胞模型构建与机制探索以及体内动物模型验证两大部分，共包含多个相互衔接的实验程序。
第一，建立体外机械张力模型与巨噬细胞极化表征。 研究使用小鼠巨噬细胞系RAW264.7作为研究对象。细胞被接种在涂有胶原的柔性硅胶膜六孔板（Bioflex板）中，利用Flexcell® FX-5000™张力系统施加周期性正弦拉伸（参数：10%拉伸强度，0.5 Hz频率）。设置了不同的拉伸时间点（0, 1, 2, 4, 6小时）以观察时间效应。随后，通过多种方法评估巨噬细胞极化状态：1) 实时定量PCR（qRT-PCR）：检测M1标志物（诱导型一氧化氮合酶，iNOS）和M2标志物（精氨酸酶-1， Arg-1；甘露糖受体C型1， MRC1；白细胞介素-10， IL-10）的mRNA表达水平。2) 蛋白质印迹（Western Blot）：检测iNOS和Arg-1的蛋白表达。3) 流式细胞术：分析细胞表面M2标志物CD206的表达比例。4) 免疫荧光染色：共定位巨噬细胞标记物F4/80和M2标记物CD206。这些实验旨在确定机械张力是否能诱导巨噬细胞向M2表型极化，并找到最佳的作用时间点。
第二，探究张力刺激下巨噬细胞条件培养基对BMSCs功能的影响。 研究者建立了间接共培养系统。将经受不同时间张力刺激后的RAW264.7细胞上清（条件培养基）收集，用于培养小鼠原代BMSCs。通过一系列功能学实验评估BMSCs的反应：1) 细胞迁移实验：采用Transwell小室实验评估BMSCs的垂直迁移能力；采用划痕愈合实验评估其侧向迁移能力。2) 细胞增殖实验：使用CCK-8试剂盒和5-乙炔基-2‘-脱氧尿苷（EdU）掺入法检测BMSCs的增殖活性。3) 成骨分化实验：在成骨诱导培养基中，使用碱性磷酸酶（ALP）染色（第7天）和茜素红S（ARS）染色（第21天）评估BMSCs的早期和晚期成骨分化能力。同时，通过qRT-PCR和Western Blot检测成骨相关基因（如Runt相关转录因子2， Runx2；osterix， Osx；骨桥蛋白， OPN；I型胶原， Col1；骨钙素， OCN；ALP）的mRNA和蛋白表达。这一系列实验旨在验证受张力刺激的巨噬细胞所营造的微环境是否能够促进BMSCs的募集、增殖和成骨。
第三，深入探究Piezo1在机械力诱导巨噬细胞极化中的核心作用及分子机制。 基于初步结果，研究者聚焦于Piezo1通道。首先，通过qRT-PCR比较了多种钙离子通道在巨噬细胞中的表达，发现Piezo1表达最高，且其表达在张力刺激2小时后显著上调。免疫荧光染色也证实了Piezo1蛋白的表达。接着，为了证明Piezo1的功能必要性，研究采用了基因敲低（Knockdown）技术，使用小干扰RNA（siRNA）特异性降低RAW264.7细胞中Piezo1的表达。在施加机械张力的同时，使用Fluo-3 AM钙离子荧光探针检测细胞内钙离子（Ca²⁺）流入情况，以验证Piezo1通道的活性。此外，还使用了Piezo1的特异性激动剂Yoda1作为阳性对照。为了探寻下游信号，研究者分析了公共数据库（GSE139121），发现Piezo1高表达与低表达组中，p53信号通路显著富集。这提示p53可能参与其中。随后，通过免疫荧光染色和Western Blot，检测了张力刺激不同时间点下，p53蛋白及其乙酰化形式（Ac-p53）的变化。并在Piezo1敲低或激活的条件下，再次检测Ac-p53水平以及M1/M2相关标志物的表达。这部分实验旨在阐明“机械力-Piezo1-钙内流-p53（去）乙酰化-巨噬细胞极化”这一信号轴。
第四，鉴定巨噬细胞分泌的关键成骨诱导因子。 鉴于M2型巨噬细胞以分泌TGF-β1等因子为特征，且TGF-β1在骨修复中作用关键，研究检测了张力刺激后巨噬细胞中TGF-β1的表达和分泌。使用qRT-PCR检测细胞内TGF-β1的mRNA水平，使用酶联免疫吸附试验（ELISA） 检测细胞上清中TGF-β1的蛋白浓度。为了功能验证，在间接共培养系统中，向条件培养基中加入不同浓度的TGF-β1中和抗体，然后再次评估BMSCs的增殖、迁移和成骨分化能力，以确定TGF-β1是否是巨噬细胞条件培养基发挥促成骨作用的关键介质。
第五，构建体内跑步小鼠模型进行整体验证。 为了在活体水平验证体外发现的机制，研究使用了6周龄雄性C57BL/6野生型小鼠。小鼠被分为五组：空白对照组（不运动）、单纯跑步组、溶剂对照组、TGF-β受体I/II抑制剂（LY-364947）注射组、Piezo1抑制剂（GsMTx4）注射组。运动方案为：在5°倾斜的跑台上，先以6 m/min适应10分钟，再以12 m/min跑20分钟，每周5天，持续4周。抑制剂在运动后每2天腹腔注射一次。干预结束后，处死小鼠，取其胫骨进行分析：1) 微型计算机断层扫描（μCT）：对胫骨远端干骺端进行扫描和三维重建，定量分析骨体积分数（BV/TV）、骨小梁厚度（Tb.Th）、数量（Tb.N）和分离度（Tb.Sp）。2) 组织学分析：胫骨切片进行苏木精-伊红（H&E）染色，观察骨小梁结构。3) 免疫荧光染色：对骨组织切片进行F4/80和TGF-β1的共染色，观察巨噬细胞募集及其TGF-β1分泌情况。体内实验旨在证实，抑制Piezo1或阻断TGF-β1信号通路，能否消除运动所诱导的骨量增加。
本研究的主要结果环环相扣，逻辑严密。在体外极化表征部分，研究发现机械张力以时间依赖的方式诱导RAW264.7细胞向M2表型极化。qRT-PCR显示，M1标志物iNOS的mRNA在拉伸1小时达到峰值后迅速下降，而M2标志物Arg-1、MRC1和IL-10的mRNA在拉伸2小时表达最高。Western Blot和流式细胞术结果一致显示，拉伸2小时组Arg-1蛋白和CD206+细胞比例显著升高。免疫荧光也清晰显示，拉伸2小时后，F4/80+CD206+双阳性细胞数量最多。这些结果明确提示，10%强度、0.5 Hz频率的机械拉伸2小时是诱导巨噬细胞M2极化的最佳参数，为后续实验提供了关键时间点。
在BMSCs功能影响部分，结果与巨噬细胞极化数据完美对应。使用拉伸2小时的巨噬细胞条件培养基处理的BMSCs，表现出最强的Transwell迁移能力、最高的CCK-8和EdU标记的增殖率，以及最快的划痕愈合速度。更重要的是，在成骨诱导实验中，该组BMSCs的ALP活性最强、钙结节（ARS染色）形成最多，同时成骨关键基因（Runx2, Osx, OPN, Col1）和蛋白的表达水平也最高。而其他时间点（如0、1、4、6小时）的条件培养基效果较弱或不显著。这直接证明了经特定参数机械张力“教育”后的M2型巨噬细胞，其分泌的因子能有效驱动BMSCs的成骨进程。
在机制探索部分，研究取得了突破性发现。首先，钙成像显示，在拉伸2小时，巨噬细胞内出现显著的钙离子内流。Piezo1的mRNA和蛋白表达也在此时上调。当使用siRNA敲低Piezo1后，机械张力诱导的钙内流显著减弱。同时，敲低Piezo1完全阻断了张力诱导的M2极化（Arg-1, MRC1, IL-10等基因表达下降），而使用激动剂Yoda1则可模拟张力效果，强烈促进M2极化。这表明Piezo1是巨噬细胞感知机械张力并启动M2极化的必要传感器。接着，对下游通路的探索发现，p53的乙酰化水平在拉伸1小时达到峰值，随后下降（即发生去乙酰化）。而敲低Piezo1会阻止这种变化，导致乙酰化p53（Ac-p53）水平持续偏高。已知Ac-p53与促炎状态相关。因此，研究者提出机制模型：机械张力通过激活Piezo1引起钙内流，钙信号导致p53发生快速的乙酰化（可能对应早期短暂的M1倾向）和随后的去乙酰化，这种p53的去乙酰化是驱动巨噬细胞向修复性M2表型持久转换的关键分子事件。
在关键因子鉴定部分，ELISA和qRT-PCR证实，拉伸刺激（特别是2小时）能显著上调巨噬细胞分泌TGF-β1。功能挽救实验显示，在间接共培养系统中加入TGF-β1中和抗体，可以剂量依赖性地抵消由张力刺激巨噬细胞条件培养基带来的促BMSCs增殖、迁移和成骨分化的效应。这确凿地证明，TGF-β1是M2型巨噬细胞在机械力刺激下促进BMSCs成骨的关键分泌因子。
在体内验证部分，结果有力地支持了体外机制。μCT分析显示，为期4周的跑步运动能显著增加小鼠胫骨的骨量（BV/TV、Tb.Th、Tb.N增加，Tb.Sp减小）。然而，无论是注射Piezo1抑制剂GsMTx4还是注射TGF-β受体抑制剂LY-364947，都完全阻断了运动带来的骨量增加，其骨参数与不运动的空白对照组无差异。H&E染色直观显示了跑步组更致密的骨小梁网络在抑制剂组中消失。更重要的是，骨组织免疫荧光显示，跑步能促进骨组织中F4/80+巨噬细胞的募集，并且这些细胞高表达TGF-β1；而注射GsMTx4则显著减少了TGF-β1+的巨噬细胞数量。这就在活体层面上完整地串联起了整个故事线：运动产生机械力 -> 骨组织内巨噬细胞通过Piezo1感知力信号 -> 巨噬细胞极化为M2表型并分泌TGF-β1 -> TGF-β1作用于骨祖细胞/BMSCs促进骨形成 -> 最终导致骨量增加。
本研究的结论是：机械张力通过激活巨噬细胞上的Piezo1离子通道，引起钙内流，并调控转录因子p53的乙酰化与去乙酰化动态平衡，从而驱动巨噬细胞从促炎表型向修复性M2表型极化。M2型巨噬细胞进而分泌并激活TGF-β1，TGF-β1作为关键信号分子，刺激骨髓间充质干细胞（BMSCs）的迁移、增殖和成骨分化，最终促进骨形成。这项研究首次系统地揭示了从机械力感受器（Piezo1）到免疫细胞（巨噬细胞）表型重编程，再到生长因子（TGF-β1）信号释放，最终调控干细胞（BMSCs）命运以促进骨形成的完整信号传导通路。
该研究具有重要的科学价值与应用价值。在科学上，它将生物力学、免疫学和骨生物学紧密联系起来，深化了“骨免疫”和“机械生物学”领域的内涵，为理解力学刺激如何通过免疫系统调控组织再生提供了一个范式。它明确了Piezo1-p53轴在巨噬细胞机械感应中的核心作用，并确定了TGF-β1是连接免疫反应与成骨效应的关键效应分子。在应用上，该研究为临床骨相关疾病（如骨折延迟愈合、骨质疏松、正畸骨改建、颌骨牵张成骨）的治疗提供了新的靶点和思路。例如，开发靶向激活巨噬细胞Piezo1通道或促进M2极化的药物或生物材料，可能成为一种促进骨再生和修复的新策略。同时，研究也强调了适度力学刺激（如康复锻炼）对于维持骨骼健康的重要性及其潜在的免疫学基础。
本研究的亮点在于：1. 研究视角新颖：聚焦于巨噬细胞这一免疫细胞作为机械力信号的中转站，揭示了其在力-骨形成耦合中不可或缺的桥梁作用。2. 机制解析深入：不仅发现了Piezo1是必需的传感器，还深入挖掘了下游的p53（去）乙酰化这一表观遗传调控节点，将机械信号与细胞核内的转录调控直接联系起来，机制链条完整。3. 实验体系完备：从体外细胞拉伸模型、基因操作、共培养系统，到体内运动动物模型和药理学阻断，研究设计立体，证据链坚实，体外机制与体内功能相互印证。4. 发现具有时空动态性：精确捕捉了机械刺激下巨噬细胞极化（2小时为峰）和p53乙酰化状态（1小时峰后下降）的精细时间动力学，使机制描述更为精准。5. 转化意义明确：明确指向TGF-β1作为可干预的靶点，并为运动促骨健康提供了分子免疫学解释。
此外，研究者在讨论中也坦诚指出了本工作的局限性，例如GsMTx4并非Piezo1的特异性抑制剂；体内模型中，TGF-β1也可能来源于其他细胞；未来需要使用巨噬细胞条件性基因敲除小鼠来获得更确凿的证据。这些思考体现了研究的严谨性，并为后续探索指明了方向。