学术研究报告：靶向CD47基因编辑联合核靶向BNCT药物治疗胶质母细胞瘤的多功能纳米脂质体递送系统

第一作者及机构
本研究的通讯作者为浙江大学药学院的韩敏（Min Han）教授和魏启春（Qichun Wei）教授，第一作者为陈杰建（Jiejian Chen）和戴奇（Qi Dai）。合作单位包括浙江大学医学院附属第二医院放射肿瘤科及华南理工大学医学院附属广州市第一人民医院肿瘤科。研究成果于2022年发表在Journal of Nanobiotechnology（2022年影响因子未明确），论文标题为《Therapeutic nucleus-access BNCT drug combined CD47-targeting gene editing in glioblastoma》。

学术背景
胶质母细胞瘤（Glioblastoma, GBM）是中枢神经系统最常见的原发性恶性肿瘤，患者中位生存期仅8-15个月，术后复发率高且缺乏有效治疗手段。硼中子俘获治疗（Boron Neutron Capture Therapy, BNCT）是一种基于核反应的二元靶向放疗技术，通过硼-10（¹⁰B）与热中子反应产生高能α粒子和锂核，选择性杀伤肿瘤细胞。然而，现有临床硼递送剂（如BSH和BPA）存在肿瘤靶向性不足、核内硼浓度低等问题，且无法解决肿瘤干细胞（GSC）导致的复发。此外，肿瘤细胞高表达的CD47蛋白通过与巨噬细胞表面SIRPα结合传递“别吃我”信号，逃避免疫清除。本研究旨在开发一种多功能纳米脂质体递送系统，结合核靶向BNCT药物与CRISPR-Cas9介导的CD47基因编辑，实现BNCT与免疫治疗的协同增效。

研究流程与方法
1. 核靶向硼递送剂（Dox-CB）的合成与验证
- 合成方法：通过阿霉素（Doxorubicin, Dox）的氨基与1-溴甲基-邻碳硼烷（CB）的溴代反应构建Dox-CB复合物，利用Dox的核定位特性实现硼的核内递送。
- 结构验证：通过¹H-NMR、¹¹B-NMR、红外光谱（IR）和质谱（MS）确认Dox-CB的化学结构，并检测硼含量（4.79%±0.16%）。
- 核靶向性验证：激光共聚焦显微镜显示Dox-CB在GL261细胞核内富集，ICP-MS测定核内硼浓度达24.96±1.81 ng/10⁶细胞，是BNCT治疗阈值的3倍。

1. 多功能纳米脂质体（Dox-CB@Lipo-pDNA-iRGD）的构建

   • 脂质体组成：采用DOTAP/DOPE/胆固醇/DSPE-PEG5000（摩尔比0.8:1:0.5:0.023）制备阳离子脂质体，通过电荷作用压缩CRISPR-Cas9质粒（靶向CD47基因的sgRNA）。
     
   • iRGD修饰：在脂质体表面偶联肿瘤穿透肽iRGD（序列CRGDK/RGPDC），增强血脑屏障穿透和肿瘤靶向。
     
   • 特性表征：动态光散射（DLS）显示脂质体粒径约150 nm，zeta电位+25 mV；透射电镜（TEM）证实其球形结构。

2. 体外功能验证

   • 基因编辑效率：Western blot和流式细胞术显示，Lipo-pDNA-iRGD可显著降低GL261细胞的CD47表达（p<0.01），优于商业化转染试剂Lipofectamine 2000。
     
   • 巨噬细胞吞噬实验：原代骨髓来源巨噬细胞对CD47敲除的GL261细胞吞噬率显著提高（p<0.05）。
     
   • 细胞毒性：CCK-8实验表明，Dox-CB的IC50>10 μg/mL，毒性低于游离Dox，而脂质体在N/P=2时细胞存活率>50%。

3. 体内抗肿瘤效果评估

   • 动物模型：C57BL/6小鼠原位GL261胶质瘤模型，通过MRI和生物发光成像验证建模成功。
     
   • 治疗方案：分为9组，包括瘤内注射Dox-CB@Lipo-pDNA-iRGD联合中子照射（2 h，热中子通量1.58×10⁸/s）、静脉注射BSH对照组等。
     
   • 生存分析：联合治疗组小鼠中位生存期显著延长（66天存活率>80%，p<0.0001），而单用BNCT或免疫治疗组生存率均低于50%。
     

4. 免疫与分子机制

   • Western blot：联合治疗组肿瘤组织中CD47、Nestin（GSC标志物）表达显著下调。
     
   • 组织学分析：Ki67染色显示肿瘤增殖抑制，TUNEL染色证实细胞凋亡增加。脾脏和肝脏毒性评估显示纳米脂质体安全性优于BSH。

主要结果与逻辑关联
1. 核靶向递送：Dox-CB通过Dox的核定位信号（NLS）将硼递送至细胞核，核内硼浓度满足BNCT需求（>20 μg/g），为后续中子照射提供基础。
2. 免疫激活：CRISPR-Cas9敲除CD47后，巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬率提升，解决了BNCT后残留GSC导致的复发问题。
3. 协同增效：体内实验证实，BNCT与CD47阻断的联合治疗显著抑制肿瘤生长并延长生存期，且纳米脂质体的脑靶向性优于传统BSH。

研究价值与意义
1. 科学价值：首次将核靶向BNCT药物与基因编辑免疫治疗结合，揭示了CD47-SIRPα通路在GBM治疗中的关键作用。
2. 应用价值：Dox-CB@Lipo-pDNA-iRGD为GBM提供了一种高集成度的治疗方案，临床转化潜力显著。
3. 技术创新：
- 自研Dox-CB复合物解决了硼核内递送的难题；
- iRGD修饰脂质体突破了血脑屏障限制；
- CRISPR-Cas9质粒的高效转染体系为实体瘤免疫治疗提供新策略。

研究亮点
1. 多重靶向：同时实现肿瘤组织靶向（iRGD）、细胞核靶向（Dox）和免疫检查点靶向（CD47）。
2. 低毒性：Dox-CB的毒性显著低于游离Dox，且脂质体载体生物相容性良好。
3. 临床兼容性：所用材料（如DOTAP、CB）均已获批临床使用，加速了转化进程。

补充价值
研究还发现，联合治疗可降低肿瘤干性标志物（CD133、Nestin）表达，为抑制复发提供了分子层面的解释。肝肾功能和心毒性评估进一步验证了该方案的安全性优势。