该文档是一篇于2025年6月发表在《European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics》上的综述文章，题为“蛋白稳定性和冷冻溶液中的关键稳定剂”，第一作者Jinghan Li来自明尼苏达大学药学院，通讯作者为同一作者。
本文全面综述了治疗性蛋白质在冷冻加工与储存过程中面临的挑战、潜在的失稳机理以及关键的稳定策略。文章指出，冷冻是生物制品生产与储存中的常见单元操作，但在冰晶形成过程中，蛋白质和其他溶质会被排阻，形成高度浓缩的冷冻浓缩溶液。这虽然可能因低温和高粘度而稳定蛋白，但同时也会引发温度、pH、离子强度变化以及冰-溶液界面形成等一系列胁迫，导致蛋白质发生物理和化学失稳，如变性、聚集等。文章的核心目的在于系统梳理这些胁迫因素，深入探讨常用稳定剂（如糖类、表面活性剂、氨基酸）的作用机制与相行为，并强调冷冻过程与稳定剂选择对后续成功冻干的重要性。
文章的核心观点可归纳为以下几个主要部分，每个部分都包含了详细的机理阐述与支持性证据：
冷冻蛋白质溶液中的胁迫因素 这部分详细阐述了在冷冻及储存过程中导致蛋白质失稳的四个关键物理化学因素。首先是温度的影响。蛋白质不仅在高温下会热变性，在极低温度下也会发生冷变性，这是由于疏水作用被削弱，溶剂分子更容易渗透到蛋白质疏水内部所致。然而，当溶液温度降低到冷冻浓缩溶液的玻璃化转变温度（Tg‘）以下时，体系粘度急剧增大，分子运动性被极大限制，从而能动力学地抑制蛋白质的变性与聚集。因此，控制冷冻速率至关重要：过慢的冷却会使蛋白质在高于Tg‘的移动性溶液中停留过久，增加失稳风险；过快冷却则会产生大量小冰晶，增大界面面积。
其次是冰的作用。冰晶的形成产生了巨大的冰-溶液界面，蛋白质可能在此界面发生吸附、展开，进而引发聚集。研究表明，蛋白质通常不直接与冰面结合，而是富集在冰晶表面的准液体层中。因此，倾向于形成大冰晶（表面积小）的慢速冷冻通常有利于减少界面胁迫。然而，在解冻过程中，冰的重结晶会产生机械和界面应力，因此快速解冻并辅以搅拌是推荐的策略，但需注意避免剪切力导致的失稳。此外，新近研究指出，冷冻过程中形成的气泡也可能加速蛋白质聚集，其危害性甚至不亚于冰界面。
第三是盐浓度的变化。冷冻过程中高达99%的水结晶，导致剩余液相中的溶质浓度急剧上升（可达两个数量级）。这会显著改变离子强度，影响蛋白质的胶体稳定性（蛋白质-蛋白质相互作用）和构象稳定性。根据霍夫迈斯特序列，离液离子会优先结合蛋白质表面（盐溶效应），促进去折叠；而亲液离子则被排除在蛋白质表面外（盐析效应），稳定天然构象。尽管高盐浓度带来挑战，但低温和高粘度环境可以动力学地抑制其负面影响，尤其是当初始盐浓度控制得较低时。
第四是pH的偏移。缓冲盐的选择性结晶是导致冷冻溶液pH剧烈变化的主要原因。例如，磷酸氢二钠十二水合物（Na2HPO4·12H2O， DPDH）的结晶会导致磷酸钠缓冲液pH下降3-4个单位，引发蛋白质聚集。而Tris缓冲液则因其pKa值对温度高度敏感，冷却时即使无盐结晶也会导致pH上升。因此，应避免使用易结晶的缓冲盐（如磷酸二钠）或pKa对温度敏感的缓冲液（如Tris）。文章也指出，高浓度（>50 mg/mL）的单克隆抗体自身具有缓冲能力，为开发无缓冲剂配方提供了可能。
冷冻蛋白质溶液中的稳定机制与关键稳定剂 文章系统阐述了稳定剂（或称冷冻保护剂）的作用原理，主要包括：在初始冷冻阶段，糖类通过优先排阻机制稳定蛋白质；在水大量结晶后，通过水置换理论，其羟基与蛋白质形成氢键；以及通过玻璃化假说，形成高粘度的冷冻浓缩液来动力学固定蛋白质分子。随后，文章聚焦于三类关键稳定剂。
第一类是糖类，特别是蔗糖和海藻糖。它们通过氢键作用和形成高粘度环境来稳定蛋白质。两者在液态配方中效果相似，但在冷冻状态下行为有显著差异。海藻糖在冷冻溶液中表现出更高的相分离倾向，可能结晶（如二水合物形式）或发生非晶相分离，形成“蛋白质富集”和“糖富集”的区域，这可能导致蛋白质失稳。而蔗糖则更倾向于保持非晶态均一相。因此，尽管两者Tg‘相近，但蔗糖被认为是冷冻溶液中更可靠的稳定剂。
第二类是表面活性剂，主要用于防止蛋白质在冰界面的吸附。最常用的是聚山梨酯20和80（PS20， PS80）。它们通过竞争性占据界面来保护蛋白质。然而，市售聚山梨酯是包含多种酯类化合物、游离脂肪酸等的复杂混合物，其组成差异可能影响稳定效果。聚山梨酯易发生水解和氧化降解，产生可见和亚可见颗粒。作为替代品，泊洛沙姆188（P188）受到关注。它的临界胶束浓度更高，需使用较高浓度。研究表明，P188不仅能通过竞争吸附保护蛋白质，其自身在冷冻时形成的液晶相还可能直接与蛋白质相互作用，提供额外的稳定效果。此外，高浓度蛋白质自身也能通过“自我稳定”效应减轻界面胁迫。
第三类是氨基酸，作为多功能辅料使用。L-蛋氨酸常用作抗氧化剂。L-精氨酸和L-组氨酸则因其稳定和降低粘度的功能而备受关注。精氨酸（通常以其盐酸盐形式使用）与蛋白质有弱相互作用，这虽可能轻微削弱构象稳定性，但能有效抑制蛋白质-蛋白质间的吸引作用，从而提高胶体稳定性并降低高浓度配方粘度，这解释了其“减粘剂”的作用。在冷冻溶液中，精氨酸盐也可作为冷冻保护剂，但其相行为取决于抗衡离子。精氨酸盐酸盐易于结晶（尤其在有甘露醇等结晶剂存在时），结晶会导致蛋白质聚集；而其醋酸盐、天冬氨酸盐和谷氨酸盐则更易保持非晶态，具有更高的Tg‘和更好的稳定效果。L-组氨酸常用作缓冲剂，其pKa值也受温度影响，但其盐在冷冻溶液中结晶倾向低，且其咪唑环可与蛋白质疏水域相互作用，提供类似精氨酸的稳定功能。
冷冻蛋白质溶液的表征技术 文章强调了原位表征技术对于理解冷冻状态下蛋白质稳定性和辅料相行为的重要性。在辅料相行为方面，差示扫描量热法（DSC）和X射线衍射（XRD）是常用技术，用于测定共晶熔点、Tg‘及鉴定结晶形式。固态核磁共振（ssNMR）是一种强大的定量工具，可同时研究冷冻溶液中各组分的状态和相变，如使用31P ssNMR监测磷酸缓冲液结晶，利用13C谱区分“可动”和“固态”组分，并可定量测定未冻水含量、计算离子强度和pH，提供传统方法难以获得的信息。 在蛋白质稳定性表征方面，原位红外和拉曼显微技术可用于绘制冷冻溶液中水、蛋白质和辅料的空间分布，并分析蛋白质二级结构和辅料结晶情况。例如，红外显微光谱能识别甘露醇和海藻糖的结晶峰，并通过酰胺II带位移评估蛋白质水合状态。小角X射线和中子散射（SAXS/SANS）能研究蛋白质在冷冻/解冻过程中的构象变化和聚集行为。例如，SANS研究揭示了乳酸脱氢酶（LDH）在磷酸缓冲液冷冻过程中因pH下降导致的不可逆聚集，以及在组氨酸缓冲液中的可逆聚集；同时，SANS也证实了PS20防止蛋白质吸附的效果，并观察到P188液晶相与溶菌酶的可能相互作用。
冷冻溶液对蛋白质冻干的影响 文章最后讨论了冷冻过程和配方设计对成功冻干的重要性。冷冻过程本身是冻干的第一步，慢速冷却（如0.5–1°C/min）有利于形成大冰晶，从而减少初级干燥时的传质阻力，获得多孔性良好的饼块，并缩短复溶时间。采用退火或控核技术（如冰雾法、降压法）可进一步促进冰晶生长，减少瓶间差异。 辅料在冷冻溶液中的相行为直接决定初级干燥温度。若使用结晶型赋形剂（如甘露醇），干燥需在共晶熔点（Teu）以下进行以防塌陷。甘露醇的结晶形态（无水型或半水合物）会影响最终冻干饼的稳定性，半水合物脱水释放的“自由水”可能诱发其他非晶态稳定剂（如蔗糖）结晶。若无结晶组分，初级干燥温度需基于Tg‘设定。某些辅料（如精氨酸盐酸盐、P188）的Tg‘很低，可能迫使干燥在极低温度下进行，或需添加高Tg‘辅料（如糖、蛋白质）以提高允许的干燥温度。文章特别指出，对于高浓度蛋白质配方，实际塌陷温度可能远高于Tg‘，允许在较高温度下进行高效干燥，但大冰晶的形成对于保证干燥效率和饼块孔隙率仍然关键。
综述的意义与价值 这篇综述文章具有重要的科学价值与应用指导意义。它系统性地整合了治疗性蛋白质在冷冻过程中复杂的物理化学变化、失稳机理及稳定策略，为生物制药领域的配方科学家和工艺工程师提供了全面的理论框架和实践指南。文章特别强调了原位表征技术在揭示冷冻状态下分子层面事件的关键作用，以及辅料相行为相容性对最终产品稳定性的深远影响。它不仅总结了经典理论（如优先排阻、水置换、玻璃化），还纳入了最新研究发现（如气泡的影响、P188的液晶相作用、精氨酸不同盐形式的差异），并对新兴的高浓度蛋白质制剂和冻干工艺挑战提出了见解。因此，该综述是开发生物制品稳健冷冻配方和工艺的重要参考文献，其原理和经验也可延伸应用于肽、核酸、细胞等新兴生物治疗领域的低温保存。