肝癌表观遗传调控新机制：ATAC-seq与RNA-seq整合分析揭示致癌基因PRPF3及其转录因子ZNF93的作用

作者及发表信息
本研究由南开大学医学院天津市第一中心医院肝胆外科张亚民团队主导，联合天津医科大学天津市第一中心医院临床研究所等机构合作完成，第一作者为白毅、邓西月等。研究成果发表于2024年的*Clinical Epigenetics*期刊（卷16期154页），标题为”Integrative analysis based on ATAC-seq and RNA-seq reveals a novel oncogene PRPF3 in hepatocellular carcinoma”。

学术背景
肝细胞癌（HCC）是全球癌症死亡的第二大原因，尽管靶向治疗和免疫治疗取得进展，但晚期患者预后仍不理想。表观遗传调控（Epigenetic regulation）作为不改变DNA序列的基因表达调控机制，在肿瘤发生中起关键作用。染色质可及性（Chromatin accessibility）通过影响转录因子（Transcription factors, TFs）结合调控基因表达，但其在HCC中的具体机制尚不明确。本研究利用转座酶可及染色质测序（Assay of Transposase Accessible Chromatin sequencing, ATAC-seq）技术，结合RNA测序（RNA-seq），旨在发现HCC中染色质开放区域的关键调控因子及其下游靶基因，揭示新的治疗靶点。

研究流程与方法
1. 样本与数据采集
- 收集4对HCC患者的肿瘤及癌旁组织（距离肿瘤边缘>1 cm），经病理确认。样本来自天津市第一中心医院2019年12月至2020年4月的手术病例（表S1）。
- 对每对样本进行ATAC-seq测序（委托上海伯豪生物技术公司），同时从TCGA数据库获取371例HCC和50例正常肝组织的RNA-seq数据。

1. ATAC-seq数据分析

   • 数据预处理：使用Bowtie2将测序reads比对至人类参考基因组（hg38），过滤低质量及重复序列（samtools），保留映射质量≥30的reads。
     
   • 峰检测与差异分析：通过MACS2识别开放染色质区域，MANORM2比较肿瘤与正常组织的差异可及区域（Differentially Accessible Regions, DARs）。
     
   • 功能注释：使用ChIPseeker对DARs进行基因组区域注释，ClusterProfiler进行KEGG通路富集分析，HOMER预测转录因子结合基序。

2. RNA-seq整合分析

   • 通过edgeR鉴定差异表达基因（Differentially Expressed Genes, DEGs），筛选标准为|log2FC|>1且p<0.05。
     
   • 将DARs与DEGs关联分析（Pearson相关性，p<0.05），筛选出22个与DARs显著相关的DEGs，其中PRPF3和PLIN2在4组样本中均重复出现。

3. 功能验证实验

   • 体外实验：在MHCC-97H和Huh7细胞系中，通过siRNA敲低或慢病毒过表达PRPF3/ZNF93，采用CCK-8、集落形成、EdU掺入实验检测增殖能力，Transwell和划痕实验评估迁移侵袭能力。
     
   • 体内实验：将稳定过表达PRPF3/ZNF93的Huh7细胞接种裸鼠皮下，14天后比较肿瘤体积和重量。
     
   • 机制验证：通过ChIP-seq确认ZNF93与PRPF3启动子结合，qRT-PCR和Western blot验证其调控关系。

主要结果
1. DARs特征与通路富集
- HCC组织中上调的DARs富集于MAPK、FOXO信号通路，与ETS和AP-1转录因子家族相关；下调DARs关联TGF-β、cAMP和p53通路，受CTCF家族调控（图1）。
- PRPF3启动子区域在肿瘤中染色质开放程度显著增高（图2d），其mRNA表达水平在TCGA队列中上调（图2e），且高表达与患者不良预后相关（图2h）。

1. PRPF3的致癌功能

   • 敲低PRPF3抑制HCC细胞增殖（CCK-8吸光度下降40%-50%）、迁移（Transwell细胞数减少60%）和侵袭（划痕愈合率降低55%）（图3）。
     
   • 过表达PRPF3则促进上述表型，裸鼠成瘤实验显示肿瘤体积增加2.1倍（图S4h）。

2. ZNF93-PRPF3调控轴

   • 生物信息学预测和ChIP-seq证实ZNF93结合PRPF3启动子（图4a）。ZNF93在HCC中高表达，与PRPF3呈正相关（r=0.57）。
     
   • 敲低ZNF93可抑制PRPF3表达及HCC恶性表型，而ZNF93过表达的效果可被PRPF3敲低逆转（图6），证实ZNF93通过转录激活PRPF3发挥促癌作用。

结论与意义
本研究首次通过多组学整合分析揭示：
1. 科学价值：发现PRPF3作为HCC新型致癌基因，其表达受ZNF93转录调控，二者形成正反馈环路驱动HCC进展。
2. 应用价值：PRPF3/ZNF93可作为预后标志物和潜在治疗靶点，为克服HCC靶向治疗耐药提供新思路。
3. 方法论贡献：建立ATAC-seq与RNA-seq联合分析流程，为表观遗传调控研究提供范式。

研究亮点
1. 创新性发现：首次报道PRPF3在HCC中的致癌作用及ZNF93-PRPF3调控轴。
2. 技术整合：结合高通量测序与功能实验，从表观遗传到表型全面验证。
3. 临床相关性：基于TCGA和独立队列验证PRPF3的预后价值，增强转化医学意义。

局限性
PRPF3促进HCC的具体分子机制（如下游信号通路）及ZNF93结合位点的精确鉴定需进一步研究。