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研究背景与信息

这篇文章标题为《ADGRE1 (EMR1, F4/80) is a rapidly-evolving gene expressed in mammalian monocyte-macrophages》，发表于开放获取的期刊 Frontiers in Immunology，发布时间为2018年10月1日。文章作者为 Lindsey A. Waddell、Lucas Lefevre、Stephen J. Bush 等，主要研究机构包括英国爱丁堡大学的 Roslin Institute 和澳大利亚昆士兰大学 Mater 研究所等。文章的通讯作者是 David A. Hume。

这项研究聚焦于粘附型 G 蛋白偶联受体 (Adhesion G Protein-Coupled Receptor, ADGRE1)，这一分子在哺乳动物单核-巨噬细胞中的表达及快速进化过程。ADGRE1 通常用于标记小鼠来源的单核-巨噬细胞谱系，但在其他物种中，尤其是大动物和人类，其作为标记的作用仍未充分明确。因此，本文旨在拓展我们对 ADGRE1 基因进化、转录机制以及异种功能差异的理解。

研究背景与目的

学术背景：
单核-巨噬细胞在哺乳动物免疫系统中起着核心作用，其分布从循环单核细胞延伸至多种组织巨噬细胞。F4/80 抗原（由 ADGRE1 基因编码）长期作为一种经典的巨噬细胞标记被用于小鼠研究。但在物种间，该基因表达的功能性差异、分子调控特性以及与免疫选择的快速进化关系，仍存在许多未解答的问题。

研究目标：
1. 鉴定基因 ADGRE1 在不同哺乳动物物种（包括猪、人类等）的表达模式。 2. 利用 RNA 测序 (RNA-seq)，研究基因的转录调控及物种/组织特异性。 3. 探讨 ADGRE1 在免疫上的潜在功能作用。 4. 开发一种能够有效结合猪 ADGRE1 蛋白的单克隆抗体，并用于功能性验证。

研究流程与方法

研究设计与对象：

1. 研究对象：包含小鼠、猪、人类、马、羊等 8 个哺乳动物物种的骨髓来源的巨噬细胞 (Bone Marrow-Derived Macrophages, BMDM) 和肺泡巨噬细胞 (Alveolar Macrophages)。
2. 生物技术方法：RNA 测序分析、嵌套式 PCR 技术、流式细胞术、免疫组化。

分步流程：

步骤1：采集 RNA-seq 数据
- 通过已有公开数据库及课题组生成的 RNA-seq 数据，研究从骨髓衍生的单核-巨噬细胞的 ADGRE1 转录水平及特异性表达。 - 每个物种数据量样本足够深度（如人类肺泡巨噬细胞 n=6），以确保统计的准确性。

步骤2：单克隆抗体开发与验证
- 选用猪骨髓细胞表达的 ADGRE1 作为免疫原，利用异源表达和免疫化学方法，构建猪 ADGRE1 的全外显子融合蛋白，并用于小鼠免疫后融合杂交瘤细胞。 - 根据 ELISA 和流式细胞术对抗体的特异性进行检测，筛选出高度特异性单克隆抗体（命名为 ROS-4E12-3E6）。

步骤3：物种间转录异构体的分析
- 分析生物信息学中 RNA-seq 数据生成的 Sashimi 图，探讨各物种 ADGRE1 基因内各外显子的剪接跳跃事件。 - 比较猪、小鼠、人类 ADGRE1 外显子区域的保守性及变异性，确定其异构体变化的进化可能性。

步骤4：组织分布与功能标记验证
- 使用流式细胞术检测猪 ADGRE1 在不同免疫细胞亚群（如骨髓、血液、肺泡巨噬细胞中）的表达变化。 - 结合免疫组化对 ADGRE1 在肝脏和肺部巨噬细胞的标记特性进行组织定性比较。

步骤5：诱导实验
- 注射重组 CSF1 蛋白（巨噬细胞集落刺激因子）以评估 ADGRE1 表达水平在猪单核细胞分化过程中的可塑性。

研究结果

1. 转录组学发现：
   

• ADGRE1 在所有被研究的哺乳动物物种中均有表达，但表达水平和模式存在跨物种的显著差异。例如，猪巨噬细胞 ADGRE1 mRNA 表达水平显著高于小鼠，但在人类中伴随脂多糖 (LPS) 刺激而上调。
• RNA-seq 数据揭示某些物种（如羊）具有新的未注释的外显子，这些外显子可能在剪接中发生跳跃。

1. 单克隆抗体的特异性与验证：
   

• 成功开发了特异性识别猪 ADGRE1 蛋白的单克隆抗体（ROS-4E12-3E6），并通过流式细胞术和免疫组化验证。
• 该抗体显示了猪肺泡巨噬细胞和粒细胞中特异的高表达，尤其是粒细胞的膜表面表达与小鼠迥异。

1. 组织与分子功能研究：
   

• 免疫组化结果显示，猪 ADGRE1 高表达于肝脏及肺部巨噬细胞中，并具有较强的组织特异性表达。
• 在猪模型中注射 CSF1-Fc 后，血液中单核细胞 ADGRE1 的表达显著增加，支持 CSF1 参与单核-巨噬谱系分化调控。

1. 其他功能性发现：
   

• 不同物种之间 ADGRE1 基因的快速进化主要体现在外显子结构和 EGF-like 钙结合结构域的变异模式上，与病原体的免疫选择相关。

研究结论与意义

这项研究明确了 ADGRE1 基因在哺乳动物单核-巨噬细胞中的广谱表达，展示了其物种之间的显著分子多样性与快速进化特性。在功能角度上，研究突出了 ADGRE1 蛋白可能在宿主防御中充当病原识别受体的潜在作用。此外，文章首次开发的猪 ADGRE1 单克隆抗体，为在猪模型中研究单核-巨噬细胞疾病（如肺部感染）提供了高效标记物。

这些发现具有重要的基础研究及应用前景，尤其是在跨物种的比较免疫学、药物靶点开发以及动物模型的精准医学研究中。猪作为一种人类免疫学模拟模型的重要性也得到进一步确认。

研究亮点

1. 跨物种比较的创新性：
   

• 本研究是首次将 ADGRE1 的表达在 8 个哺乳动物物种中进行系统性的多维对比。

1. 新抗体工具开发：
   

• 成功开发针对猪 ADGRE1 的高特异性单克隆抗体 ROS-4E12-3E6，并验证其在流式细胞术和免疫组化的实际应用价值。

1. 剪接复杂性的发现：
   

• RNA-seq 数据揭示物种中特异的外显子剪切跳跃现象，提示该基因编码复杂的异构体。

研究展望

未来研究可进一步探索 ADGRE1 在不同物种免疫系统中的精准功能及其病原识别的分子机制，并以此为基础开发新型免疫干预技术。