治疗性蛋白因其结构复杂、对环境敏感，在加工和储存过程中常面临稳定性挑战。冷冻是一种广泛使用的单元操作，旨在通过低温减缓分子运动，为蛋白提供稳定状态。然而，冷冻过程本身会引入一系列应力，可能导致蛋白失稳。近期发表于European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 214卷（2025年）的一篇综述文章“Protein stability and critical stabilizers in frozen solutions”，由Jinghan Li（明尼苏达大学）、Xinhao Lin和Zixuan Zhen（康涅狄格大学）撰写，系统性地总结了冷冻和融解（freeze-thaw）过程中蛋白面临的应力、稳定化策略以及关键稳定剂的作用机制，并对冷冻干燥工艺提供了深刻见解。该综述旨在为生物制药领域的研究人员和产品开发人员提供关于冷冻条件下蛋白稳定性的全面概述和实用指南。

冷冻蛋白溶液中的应力来源

文章首先详细分析了冷冻过程中导致蛋白不稳定的四个主要应力来源：温度、冰晶、盐浓度和pH值变化。

温度是影响蛋白稳定性的核心因素。蛋白不仅会在高温下发生热变性，在极低温度下也可能发生冷变性（cold denaturation）。冷变性主要由焓驱动，低温削弱了疏水效应，导致蛋白内部疏水结构暴露，二级结构丧失。然而，冷冻时大部分水结晶形成冰，溶质被排除在冰晶外，形成高粘度的冷冻浓缩溶液（freeze concentrated solution, FCS）。当温度降低至FCS的玻璃化转变温度（glass transition temperature, Tg’）以下时，体系粘度急剧升高，分子运动被“冻结”，从而能动力学地抑制蛋白的去折叠和聚集。因此，为了稳定蛋白，应避免在温度高于Tg’的区间内长时间停留，并适当控制冷冻速率，既减少蛋白在流动的未冻溶液中暴露的时间（以防冷变性），又要避免因过冷度太大而形成过多小冰晶。

冰晶是冷冻过程中不可避免的产物，其表面（冰/溶液界面）是导致蛋白不稳定的关键区域。蛋白可吸附在冰晶表面，进而发生去折叠和聚集。冰晶的表面积越大（即冰晶越小），这种界面应力就越显著。因此，通常采用较慢的冷却速率（如≤2°C/分钟）以促进形成表面积较小的大冰晶。相反，解冻过程则建议快速进行，以防止冰晶在融化过程中发生重结晶（recrystallization），因为重结晶过程会产生新的界面并伴随机械应力，同样会破坏蛋白。研究指出，蛋白通常不直接与冰面结合，而是通过聚集在冰晶表面的准液体层（quasi-liquid layer, QLL）间接相互作用。大分子蛋白（如单克隆抗体）因其扩散慢，更容易在QLL中聚集，从而对冰晶生长的抑制效果比小蛋白更强。此外，冷冻过程中溶解气体的析出形成的气泡界面，其破坏性甚至可能不亚于冰面，通过脱气过滤去除溶解气体和纳米气泡可有效缓解蛋白聚集。

盐浓度的变化是另一个主要应力。作为缓冲剂或渗透压调节剂加入的盐，在冷冻过程中，随着水的结晶，其浓度在FCS中可增加约两个数量级。低浓度盐离子可通过屏蔽蛋白表面电荷，削弱分子间静电斥力，反而可能增加聚集倾向。更高浓度时，离子与蛋白的优先相互作用（preferential interaction）决定其效果：离液序列高的离子（chaotropic ions）倾向于结合蛋白表面（“盐溶”效应），热力学上有利于蛋白去折叠；而离液序列低的离子（kosmotropic ions）倾向于被排除在蛋白表面外（“盐析”效应），能稳定蛋白的天然构象。因此，选择合适的盐类型和初始浓度至关重要。尽管高盐浓度带来挑战，但低温和高粘度环境（尤其在Tg’以下）可以动力学地抑制其负面影响。

pH 偏移是冷冻缓冲溶液中的常见问题。许多缓冲盐的溶解度具有温度依赖性，在冷冻过程中可能发生选择性结晶，导致溶液pH发生剧烈变化。例如，磷酸氢二钠（Na2HPO4）在冷却时结晶为十二水合物（DPDH），可使pH下降3-4个单位，从而引发蛋白（如牛血清白蛋白、β-半乳糖苷酶）在冻融过程中聚集。相比之下，磷酸二氢钾缓冲液则无此问题。琥珀酸缓冲液中，琥珀酸一钠结晶会导致pH升高。此外，三羟甲基氨基甲烷（Tris）缓冲液的pKa值具有强烈的温度依赖性（每降温10°C，pKa约增加0.028），即使无盐结晶，降温本身也会引起pH显著升高。因此，对于pH敏感的蛋白，应避免使用易于结晶或pKa温度依赖性强的缓冲盐。文章也指出，高浓度蛋白（>50 mg/ml）本身具有一定的自缓冲能力，这为开发无缓冲剂配方提供了可能性。

冷冻蛋白溶液中的稳定化机制与关键稳定剂

针对上述应力，配方中需要添加稳定剂（也称冷冻保护剂）。文章随后深入探讨了三种关键的稳定剂类别：糖类、表面活性剂和氨基酸，并阐述了它们的稳定机制。

糖类，尤其是蔗糖和海藻糖，是应用最广泛的蛋白稳定剂。其稳定机制包括：1) 优先排斥机制：在冷冻初期，糖类倾向于被排除在蛋白水化层外，提高蛋白去折叠的自由能势垒，稳定天然构象。2) 水替代理论：当水大量结晶后，糖类的羟基可以与蛋白表面的极性基团形成氢键，替代水分子的作用，维持蛋白的天然结构。3) 玻璃化假说：糖类形成的高粘度FCS，在温度低于Tg’时，能动力学地禁锢蛋白分子，抑制其运动、去折叠和聚集。

尽管蔗糖和海藻糖在液态配方中效果相似，但在冷冻溶液中，海藻糖表现出更高的相分离倾向。研究表明，海藻糖在FCS中更易结晶（如二水合物），且可能与蛋白发生非晶相分离，形成“蛋白富集”和“糖富集”的区域。这种相分离可能源于海藻糖与水分子的相互作用更强，竞争性地削弱了其与蛋白的作用。相比之下，蔗糖则更易形成均一的非晶态FCS。因此，从防止冷冻诱导的蛋白失稳角度来看，蔗糖可能是比海藻糖更优的选择。

表面活性剂的主要功能是防止蛋白在冰晶或其他界面上吸附和变性。最常用的是聚山梨酯20和80（Polysorbate 20/80， PS20/PS80）。它们通过在界面竞争性吸附，占据冰/溶液界面，从而将蛋白排斥在外。研究证实，PS20能有效阻止溶菌酶在冰面吸附，且不影响蛋白结构。值得注意的是，市售聚山梨酯是多种组分的复杂混合物，其纯度、脂肪酸链组成和酯化程度会影响其稳定效果。例如，异山梨醇聚氧乙烯醚单月桂酸酯和聚氧乙烯单月桂酸酯比其它组分在抵抗界面应力方面更有效。

聚山梨酯存在水解和氧化降解的风险，可能产生不溶性颗粒。作为替代，泊洛沙姆188（Poloxamer 188, P188）受到关注。P188的临界胶束浓度（CMC）远高于聚山梨酯，因此通常需要更高的使用浓度（≥0.1% w/v）。有趣的是，P188的稳定机制可能不止于竞争性界面替换。小角中子散射研究显示，P188在冷冻过程中可形成液晶相，并可能与蛋白相互作用，从而在FCS中抑制蛋白聚集。尽管P188在FCS中有结晶倾向，但非晶态溶质（如糖和蛋白）可有效抑制其结晶。P188的相行为及其与蛋白的相互作用值得进一步研究。

氨基酸，如L-精氨酸和L-组氨酸，是配方中的多功能辅料，可作为稳定剂、抗氧化剂、缓冲剂或渗透压调节剂。L-蛋氨酸是常用的抗氧化剂，可牺牲性地被氧化，保护蛋白中的甲硫氨酸、组氨酸等残基。 L-精氨酸（通常以其盐酸盐形式使用，ArgHCl）在液态配方中的稳定机制不同于糖类。它不是优先被排除，而是与蛋白发生微弱的优先结合。这种结合类似于盐酸胍（GdnHCl），但强度弱得多，因此精氨酸被视为一种“弱去稳定剂”，它轻微降低蛋白的熔解温度（Tm）。然而，从胶体稳定性角度看，这种微弱的蛋白-精氨酸相互作用可以屏蔽蛋白-蛋白间的疏水和静电吸引作用，从而改善胶体稳定性，这也是它能降低高浓度蛋白溶液粘度的原因之一。

在冷冻溶液中，精氨酸盐也可作为冷冻保护剂，其相行为取决于抗衡离子。ArgHCl在FCS中结晶倾向较高，特别是在甘露醇等结晶性辅料存在下，会促进ArgHCl一水合物结晶，并导致β-半乳糖苷酶在冻融过程中严重聚集。而精氨酸的乙酸盐、天冬氨酸盐或谷氨酸盐则倾向于保持非晶态，表现出更好的冻融稳定性，且其Tg’更高。因此，选择精氨酸盐时需考虑抗衡离子的影响。 L-组氨酸是常用的缓冲剂，其缓冲范围（pH 5.5–7.0）适合许多蛋白。虽然其pKa值也具有温度依赖性，但由其引起的pH偏移及对蛋白稳定性的负面影响报道较少。组氨酸及其盐酸盐在冷冻溶液中结晶倾向低。研究表明，组氨酸的咪唑环可以与蛋白的疏水位点相互作用，缓解蛋白-蛋白间的吸引，具有与精氨酸类似的稳定和降粘潜力。

冷冻蛋白溶液的表征技术

理解冷冻溶液中的蛋白稳定性和辅料相行为离不开先进的表征技术。文章介绍了多种原位表征方法，提供了对冷冻过程的深入洞察。 对于辅料相行为，差示扫描量热法和X射线衍射是最常用的技术。固体核磁共振（ssNMR）是一种强大的定量表征工具，可用于研究冷冻过程中溶质从“流动”态向“固体”态的转变、测定未冻水含量、离子强度，甚至计算FCS的pH。例如，通过ssNMR可以明确监测到DPDH的结晶以及组氨酸/海藻糖在Tg’附近的状态转变。 对于蛋白稳定性，原位光谱和散射技术至关重要。红外和共聚焦拉曼显微镜可以绘制冷冻溶液中水、蛋白和辅料的分布图，并提供蛋白二级结构和辅料相行为的信息。小角X射线和中子散射（SAXS/SANS）可用于表征冷冻过程中蛋白的构象变化和聚集状态。例如，SANS研究表明，乳酸脱氢酶在磷酸钠缓冲液中冻融时发生不可逆聚集，这与DPDH结晶导致的pH骤降有关；而在组氨酸缓冲液中，聚集是可逆的。SANS还揭示了表面活性剂P188与蛋白在FCS中的潜在相互作用。

冷冻溶液对蛋白冷冻干燥的影响

冷冻干燥（冻干）是提高蛋白长期稳定性的重要工艺，而冷冻步骤是冻干的基础。文章强调了冷冻过程和辅料选择对成功冻干的关键影响。 冷冻过程：为了获得多孔、易于复溶的冻干饼块，需要形成大冰晶以减少干燥时的传质阻力。因此，冻干前的冷冻通常采用慢速降温（0.5–1°C/分钟），有时还进行退火处理以促进冰晶生长和消除过冷。近年来，受控冰核技术（如冰雾法、降压法）的应用，可以主动引发冰核，减少瓶间差异，促进形成更大、更均一的冰晶。 辅料相行为：冻干初级干燥的温度设定取决于FCS的Tg’或结晶性溶质的共晶温度（Teu）。甘露醇是常用的填充剂，需要使其充分结晶以支撑冻干饼结构。但需注意，甘露醇可能结晶为不同的晶型（如无水型或半水合物），其中半水合物在储存中脱水释放的“自由水”可能引发其他无定形稳定剂（如蔗糖）的结晶，影响产品稳定性。因此，需通过工艺控制其晶型。 对于高浓度蛋白配方，Tg’与产品塌陷温度之间的差值可能很大，允许在较高温度下进行初级干燥以缩短时间。但这也带来高蒸汽阻力、复溶慢等挑战。采用慢冻和受控冰核技术形成大冰晶，有助于提高干燥效率和饼块孔隙率，加速复溶。

总结与展望

该综述系统性地总结了治疗性蛋白在冷冻和冻存过程中面临的多重应力（温度、冰、盐浓度、pH），并深入讨论了糖类、表面活性剂和氨基酸等关键稳定剂的作用机制与相行为。文章指出，设计稳健的冷冻蛋白配方和工艺需要综合考虑多个因素：通过控制冷冻/解冻速率管理冰晶大小和界面应力；储存温度应远低于FCS的Tg’以实现动力学稳定；谨慎选择缓冲盐以避免pH偏移；优化稳定剂组合，并注意辅料间可能存在的诱导结晶等不良相互作用。

文章特别强调了原位表征技术（如ssNMR、SANS、红外/拉曼显微镜）在揭示冷冻溶液真实状态方面的价值，这些技术为理解和优化配方与工艺提供了前所未有的洞察力。 最后，文章展望指出，从蛋白冷冻配方中获得的经验可扩展至肽类、核酸和细胞等新兴生物治疗药物的冷冻保存。然而，基于这些新分子实体的不同结构和稳定性特征，其配方和冷冻工艺仍需进一步优化。因此，深入理解冷冻溶液中的蛋白稳定性，设计稳健的配方和工艺，将始终是生物治疗药物开发领域的重要课题。这篇综述为此提供了全面的知识框架和宝贵的实践指导。