学术研究报告：环状RNA circVAMP3通过驱动CAPRIN1相分离抑制c-Myc翻译从而抑制肝细胞癌
一、 研究作者、机构及发表信息
本研究由陈帅、曹晓飞、张晋阳、吴婉莹、张冰和赵方庆*（通讯作者）共同完成。主要研究机构包括：中国科学院北京生命科学研究院、中国科学院大学、中国科学院大学杭州高等研究院系统生物学重点实验室以及中国科学院动物进化与遗传卓越中心。该研究成果以题为“circVAMP3 drives caprin1 phase separation and inhibits hepatocellular carcinoma by suppressing c-myc translation”的研究论文形式，于2022年发表于学术期刊 Advanced Science 上（论文编号：Adv. Sci. 2022, 9, 2103817）。
二、 学术背景与研究目的
本研究属于分子肿瘤学与RNA生物学交叉领域，聚焦于环状RNA（circular RNAs, circRNAs）在肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma, HCC）发生发展中的作用机制。肝细胞癌是全球范围内发病率和死亡率极高的恶性肿瘤，尽管治疗手段不断进步，但其高复发和转移率导致患者预后仍然很差。因此，深入探究HCC的分子病理机制并寻找新的诊断和治疗靶点具有迫切需求。
环状RNA是一类由前体mRNA反向剪接形成的闭合环状非编码RNA分子，具有结构稳定、组织特异性表达等特点。近年来研究发现，circRNAs在多种生物学过程及人类疾病（包括癌症）中扮演重要调控角色。在HCC中，部分circRNAs被证实异常表达并参与肿瘤进程，但其具体分子机制，尤其是circRNAs与蛋白质相互作用并影响肿瘤表现的功能，仍有待深入挖掘。
本研究旨在通过对HCC组织进行circRNA表达谱筛查，鉴定在HCC中发挥关键作用的circRNA分子，并深入解析其抑制肝癌细胞增殖和转移的分子机制。研究目标包括：1）识别在HCC中差异表达且与患者预后相关的关键circRNA；2）在体内外功能上验证该circRNA的抑癌作用；3）揭示其发挥功能的具体分子机制，特别是与蛋白质相互作用及对细胞生理过程的影响；4）探索该circRNA在其他癌症类型中的潜在普适性作用。最终，希望为HCC的诊断和治疗提供新的潜在生物标志物和干预靶点。
三、 详细研究流程与方法
本研究是一个系统性的基础与转化医学研究，流程严谨，从临床样本分析到分子机制探索，再到功能验证和普适性检验，环环相扣。
流程一：circRNA筛选与circVAMP3鉴定 * 研究对象与样本量：研究首先分析了20对HCC肿瘤组织与癌旁正常组织的核糖体RNA去除后的总RNA测序数据。 * 研究方法与实验：通过生物信息学分析（使用CIRI2和CIRIquant等工具）筛选在HCC中差异表达的circRNAs。重点关注那些表达丰度和连接点比率（back-spliced junction reads / forward-spliced junction reads）均发生显著变化，而其宿主基因mRNA表达未发生显著变化的circRNAs。 * 数据分析流程：从差异表达的circRNAs中，选择了一个此前未被研究、且在HCC组织中下调最显著的候选分子——circVAMP3进行后续研究。circVAMP3由VAMP3基因的第3和第4外显子环化形成。 * 验证实验：通过设计跨反向剪接位点的发散引物进行PCR和Sanger测序，确认了circVAMP3的环状结构。使用RNase R消化实验证明circVAMP3比线性VAMP3 mRNA更稳定。通过RNA荧光原位杂交（FISH）和细胞组分分离RT-qPCR，确定circVAMP3主要定位于细胞质。
流程二：circVAMP3的临床相关性分析 * 研究对象与样本量：收集了118例HCC患者的肿瘤及配对癌旁组织样本。 * 研究方法与实验：使用RT-qPCR检测circVAMP3在118对临床样本中的表达水平。分析其表达与患者临床病理特征（肿瘤分期、大小、血管侵犯）的相关性。采用Kaplan-Meier生存分析评估circVAMP3表达水平与患者总生存期的关系。
流程三：circVAMP3在HCC中的生物学功能验证（体外与体内） * 研究对象：人HCC细胞系SMMC-7721和Huh7。 * 研究方法与实验： * 功能获得与缺失：构建circVAMP3过表达质粒以及靶向其反向剪接位点的特异性短发夹RNA（shRNA）慢病毒载体，分别在SMMC-7721和Huh7细胞中稳定过表达或敲低circVAMP3。 * 体外功能实验：通过MTS assay、EdU染色实验、克隆形成实验评估细胞增殖能力；通过Transwell迁移实验评估细胞迁移能力。 * 体内功能实验：将稳定过表达或敲低circVAMP3的SMMC-7721细胞皮下注射到裸鼠体内，观察肿瘤生长情况，测量肿瘤体积和重量。
流程四：circVAMP3相互作用蛋白的鉴定与验证 * 研究对象：SMMC-7721和Huh7细胞。 * 研究方法与实验： * RNA Pull-down与质谱分析：使用生物素标记的、靶向circVAMP3反向剪接位点的特异性探针进行RNA Pull-down实验，富集与circVAMP3结合的蛋白质，随后进行质谱分析。 * 互作验证：通过Western Blot验证Pull-down产物中的候选蛋白。通过RNA免疫共沉淀（RIP）实验，用CAPRIN1和G3BP1的抗体验证其与circVAMP3的结合。 * 蛋白互作网络：利用STRING数据库分析CAPRIN1的相互作用蛋白网络。 * 结构域映射：构建CAPRIN1蛋白的一系列截短体，通过RNA Pull-down和免疫共沉淀（Co-IP）实验确定circVAMP3和G3BP1与CAPRIN1结合的关键结构域。CAPRIN1的RGG结构域（607-709位氨基酸）负责结合circVAMP3，而KH2结构域（352-605位氨基酸）负责结合G3BP1。 * 体外直接结合实验：使用体外转录并环化的circVAMP3 RNA与纯化的His标签CAPRIN1和G3BP1蛋白进行体外Pull-down，证明circVAMP3直接结合CAPRIN1，而G3BP1仅在CAPRIN1存在时才能被circVAMP3间接拉下。
流程五：circVAMP3驱动CAPRIN1/G3BP1相分离与应激颗粒形成 * 研究方法与实验： * 细胞定位：通过RNA FISH结合免疫荧光（IF）共染色，观察circVAMP3、CAPRIN1和G3BP1在细胞内的共定位情况。 * 体外相分离（LLPS）：纯化CAPRIN1和G3BP1蛋白，在体外不同盐浓度和 crowding agent（葡聚糖T500）条件下，观察蛋白质液滴的形成。加入不同RNA（tRNA、总RNA、circVAMP3）观察对相分离的诱导作用。 * 体内相分离验证：在细胞中表达GFP-CAPRIN1和mCherry-G3BP1融合蛋白，观察其在细胞质中形成颗粒。使用荧光漂白恢复（FRAP）技术验证这些颗粒具有液体样特性（荧光快速恢复）。观察颗粒的融合过程。 * 应激颗粒（SG）诱导：使用亚砷酸钠处理细胞诱导应激颗粒形成，通过免疫荧光检测CAPRIN1颗粒，统计含有应激颗粒的细胞比例，分析circVAMP3过表达或敲低对此过程的影响。
流程六：circVAMP3通过抑制c-Myc翻译发挥抑癌功能 * 研究方法与实验： * 下游靶点筛选：对20对HCC/癌旁组织的RNA-seq数据进行KEGG通路富集分析，发现细胞周期通路显著富集。通过Western Blot检测circVAMP3调控后HCC细胞中多个关键蛋白（如c-Myc）的表达变化。 * mRNA与蛋白水平关联：检测c-Myc在mRNA和蛋白水平的变化，发现circVAMP3影响c-Myc蛋白水平但不影响其mRNA水平，提示存在翻译调控。 * c-Myc mRNA与SG关联：通过RIP实验证明CAPRIN1和G3BP1能结合c-Myc mRNA。通过RNA FISH结合IF，证明在应激条件下，c-Myc mRNA与CAPRIN1、G3BP1共定位于应激颗粒中，并与翻译抑制标志物磷酸化eIF2α共定位。 * 翻译抑制验证：使用蛋白质合成抑制剂（环己酰亚胺，CHX）和蛋白酶体抑制剂（MG132）处理细胞，结合Western Blot，证明circVAMP3主要通过抑制c-Myc的翻译而非影响其降解来调控其蛋白水平。
流程七：circVAMP3在多种癌症中的普适性探索 * 研究对象：宫颈癌细胞系HeLa和肺癌细胞系A549。 * 研究方法：从公共数据库（circAtlas, MiOncoCirc）分析circVAMP3在多种正常组织和对应肿瘤组织中的表达谱。在HeLa和A549细胞中敲低或过表达circVAMP3，进行EdU增殖实验和应激颗粒形成实验，验证其功能是否保守。
四、 主要研究结果及其逻辑关联
circVAMP3在HCC中低表达且与不良预后相关：生物信息学筛选和临床样本验证均表明，circVAMP3在HCC组织中显著下调。Kaplan-Meier分析显示，circVAMP3低表达的HCC患者总生存期更短。其低表达还与更大的肿瘤体积、更晚的肿瘤分期和血管侵犯相关，提示circVAMP3可能是一个抑癌因子和潜在的预后标志物。
circVAMP3抑制HCC细胞增殖和转移：体外功能实验证实，过表达circVAMP3能显著抑制SMMC-7721和Huh7细胞的增殖、克隆形成和迁移能力；而敲低circVAMP3则产生相反的效果。裸鼠皮下成瘤实验进一步在体内验证了circVAMP3的抑癌作用：过表达circVAMP3导致肿瘤体积和重量减小，敲低则导致肿瘤增大。这些结果确立了circVAMP3在HCC中的抑癌功能。
circVAMP3特异性结合CAPRIN1-G3BP1蛋白复合物：RNA Pull-down联合质谱鉴定出CAPRIN1和G3BP1是circVAMP3的关键相互作用蛋白。系列生化实验证实了三者间的相互作用：circVAMP3通过其RGG结构域直接结合CAPRIN1，而CAPRIN1通过其KH2结构域结合G3BP1，从而使得circVAMP3能够间接结合G3BP1复合物。circVAMP3可能起到“脚手架”作用，将多个CAPRIN1蛋白募集在一起。
circVAMP3驱动CAPRIN1/G3BP1发生液-液相分离并促进应激颗粒形成：CAPRIN1和G3BP1是已知的应激颗粒核心组分。本研究发现，circVAMP3与CAPRIN1/G3BP1在细胞质颗粒中共定位。体外实验证明，CAPRIN1和G3BP1在特定条件下可形成具有液体特性的液滴，且circVAMP3（而非tRNA）能有效诱导CAPRIN1及CAPRIN1/G3BP1混合物的相分离，这种诱导作用具有长度和浓度依赖性，并可被RNase A（降解线性RNA）破坏，但不被RNase R（降解线性RNA而环状RNA耐受）破坏。在细胞内，过表达circVAMP3能促进亚砷酸钠诱导的应激颗粒形成，而敲低circVAMP3则抑制其形成。这首次揭示了circRNA可以作为一种“分子支架”驱动蛋白质发生液-液相分离。
circVAMP3通过相分离抑制原癌基因c-Myc的翻译：机制探究发现，circVAMP3能下调c-Myc蛋白水平，但不影响其mRNA水平。进一步实验表明，CAPRIN1和G3BP1能结合c-Myc mRNA。在应激条件下，c-Myc mRNA被招募到由circVAMP3促进形成的应激颗粒中，并与翻译抑制因子p-eIF2α共定位。使用翻译抑制剂和蛋白酶体抑制剂的实验证实，circVAMP3主要通过抑制c-Myc的翻译来降低其蛋白水平。因此，研究提出了一个完整的信号轴：circVAMP3 → 驱动CAPRIN1相分离 → 促进应激颗粒形成 → 将c-Myc mRNA隔离至应激颗粒并抑制其翻译 → 下调c-Myc蛋白表达 → 抑制HCC细胞增殖和转移。
circVAMP3的广泛表达及其在其他癌症中的潜在抑癌作用：与大多数组织特异性circRNA不同，数据库分析显示circVAMP3在多种人体组织中广泛表达，且在多种癌症（包括HCC）中下调。在宫颈癌HeLa细胞和肺癌A549细胞中，敲低circVAMP3同样促进了细胞增殖并抑制了应激颗粒形成，而过表达则产生相反效应。这表明circVAMP3的抑癌功能及其通过相分离调控细胞过程的机制可能具有普适性。
五、 研究结论与价值
本研究系统性地鉴定并阐明了一个新的环状RNA分子——circVAMP3在肝细胞癌中的抑癌机制。主要结论如下： 1. circVAMP3在HCC中低表达，是患者预后的潜在独立预测因子。 2. circVAMP3在体外和体内均能有效抑制HCC细胞的增殖和转移。 3. circVAMP3通过直接结合CAPRIN1蛋白，驱动CAPRIN1-G3BP1复合物发生液-液相分离，促进应激颗粒的形成。 4. 在应激条件下，circVAMP3通过上述机制将原癌基因c-Myc的mRNA招募至应激颗粒中，从而抑制其翻译，最终实现抑癌功能。 5. circVAMP3在多种组织中广泛表达，并在多种癌症中下调，其抑癌功能在宫颈癌和肺癌细胞中得到初步验证，提示其可能是一个广谱的肿瘤抑制因子。
科学价值：本研究首次揭示了circRNA可以通过驱动蛋白质液-液相分离来调控细胞功能，为circRNA的功能研究开辟了全新的视角和机制维度。它将非编码RNA、相分离、应激颗粒形成和翻译调控等多个重要生物学过程联系起来，构建了一个新颖的肿瘤抑制调控网络。
应用价值：circVAMP3因其在HCC及多种癌症中的下调、与预后的相关性以及稳定的环状结构，有望成为一种新型的癌症诊断和预后生物标志物。其作用的分子机制，特别是与CAPRIN1相分离的环节，为开发针对HCC及其他癌症的新治疗策略（例如，开发模拟或恢复circVAMP3功能，或靶向CAPRIN1相分离的小分子药物）提供了潜在靶点。
六、 研究亮点
七、 其他有价值的内容
研究中对circVAMP3与线性VAMP3 mRNA进行了区分和对比，强调了circRNA由于结构稳定而更适于作为生物标志物和发挥长效调控作用的优势。此外，作者在讨论部分将本研究与领域内其他关于相分离（如lncRNA NEAT1）和翻译调控（如GIRGL lncRNA）的研究进行了联系和对比，突出了本研究发现的特异性与创新性，并展望了circVAMP3作为癌症治疗靶点的前景。研究还提供了详尽的实验方法部分，具有很高的可重复性和参考价值。