本文属于类型a，即单一原创研究论文。以下是根据该论文内容撰写的学术报告。
一、研究作者、机构与发表信息
本研究由Kanagaraju Ponnusamy与Klesti Karaxhuku作为共同第一作者，Aristeidis Chaidos与Anastasios Karadimitris作为共同通讯作者完成。研究团队主要来自英国伦敦帝国理工学院（Imperial College London）的Hugh & Josseline Langmuir骨髓瘤研究中心、血液学中心、免疫学与炎症系，以及Hammersmith医院血液科；合作机构还包括荷兰Lumicks公司、希腊约阿尼纳大学医学院和牛津大学。该论文发表于期刊 *Nature Communications*，DOI为 https://doi.org/10.1038/s41467-026-76718-7。
二、研究背景与目的
细胞免疫治疗，特别是嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor，CAR）T细胞疗法，已显著改善部分血液系统恶性肿瘤患者的预后。但对于多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）而言，治愈仍十分困难。虽然有研究显示靶向B细胞成熟抗原（B-cell maturation antigen，BCMA）的CAR-T疗法可使少数复发/难治患者获得长期微小残留病阴性状态，但整体治愈率依然较低。恒定自然杀伤T细胞（invariant natural killer T cells，iNKT）兼具固有免疫和适应性免疫特征，可通过CD1d依赖和非依赖机制杀伤肿瘤，并可作为一种“现货型”（off-the-shelf）异体细胞免疫平台，具有优于传统T细胞的多重潜力。然而，不同CAR共刺激内域（endodomain）对CAR-iNKT功能的影响尚未被系统阐明。本研究旨在通过优化CAR内域设计，并联合新开发的iNKT特异性衔接器（engager），进一步提高CAR-iNKT对MM的抗肿瘤活性。
三、研究设计、方法与流程
本研究主要包括四个递进环节：第一，构建并比较五种不同CAR内域的BCMA CAR-iNKT细胞；第二，解析CD28z CAR-iNKT优势功能的分子机制；第三，开发并验证靶向BCMA的iNKT特异性双特异性衔接器；第四，探索CAR-iNKT与衔接器联合的双靶点、双模态治疗策略。
在第一环节中，研究团队基于已临床验证的抗BCMA单链可变区片段（single-chain variable fragment，scFv）C11D5.3，利用慢病毒载体构建了五种CAR：第二代CD28z、41BBz、OX40z以及第三代CD28-41BBz和CD28-OX40z。所有CAR均采用相同的CD8α来源铰链区、跨膜区以及胞内信号域结构。研究使用来自健康供者外周血的iNKT细胞进行基因转导，并获得了高纯度且CAR表达水平相近的CAR-iNKT细胞。随后，团队通过体外细胞毒性实验、免疫突触形成成像、短期与长期增殖实验、肿瘤细胞再刺激实验以及基于声学力和剪切应力两种生物物理方法的细胞亲合力（avidity）检测，系统比较了五种CAR-iNKT的功能特征。
在第二环节中，为阐明CD28z CAR-iNKT亲合力优势的分子基础，研究者对静息状态下的CD28z、41BBz CAR-iNKT以及未转导iNKT进行了RNA测序，发现plexin D1（PLXND1）在CD28z CAR-iNKT中显著上调。随后通过流式细胞术、定量免疫荧光、PLXND1阻断抗体实验、CRISPR/Cas9敲除semaphorin 4A（SEMA4A）的MM1.S细胞模型以及PLXND1过表达拯救实验，证实了PLXND1-SEMA4A相互作用决定CD28z CAR-iNKT的较高亲合力。此外，团队还构建了靶向FCRL5的CD28z与41BBz CAR-iNKT，证明该机制不依赖于CAR靶点或scFv种类。
在第三环节中，研究团队设计并表达了两类靶向iNKT T细胞受体Vβ11链（TCRVβ11）和BCMA的双特异性iNKT衔接器（bispecific iNKT engager，BINTE）：一种是单价异源二聚体scFv-Fc形式，另一种是双价同源二聚体IgG-scFv形式。通过SDS-PAGE、流式细胞术结合实验、表面等离激元共振（surface plasmon resonance，SPR）以及体外长期杀伤实验，比较二者的亲和力与杀伤效能。结果显示双价BINTE具有更高亲和力和更强细胞毒性，因此被选用于后续研究。研究进一步在健康供者iNKT细胞、T细胞以及MM患者原代骨髓瘤细胞中验证了BINTE的特异性和抗骨髓瘤活性，并将其应用于NSG小鼠皮下与系统性骨髓瘤模型。
第四环节中，研究者建立了由50% BCMA⁺FCRL5⁺和50% BCMA⁺FCRL5⁻ MM1.S-luc细胞组成的系统性骨髓瘤模型。小鼠分别接受单独FCRL5 CAR-iNKT或FCRL5 CAR-iNKT联合BCMA BINTE治疗，通过生物发光成像、流式细胞术和生存分析评估双靶点策略的抗肿瘤效果及对肿瘤免疫逃逸的限制作用。数据通过Mann–Whitney U检验、非配对t检验以及Gehan–Breslow–Wilcoxon检验等进行统计处理；亲合力检测使用了Lumicks公司的声学力与剪切应力平台。
四、主要研究结果及各环节间的逻辑关系
第一环节的核心结果是CD28z CAR-iNKT在五种设计中表现出最高的增殖能力和细胞亲合力。尽管五种CAR-iNKT在24小时细胞毒性实验中具有相似的杀伤能力，且在与骨髓瘤细胞形成免疫突触方面无明显差异，但CD28z CAR-iNKT在IL-15存在下的长期扩增能力、在肿瘤细胞存在下的实时增殖能力以及对MM1.S和H929细胞的亲合力均显著高于其他设计。这一结果提示，传统短期杀伤实验可能无法充分反映CAR结构差异对体内疗效的影响，而亲合力可能是更可靠的预测指标。因此，研究团队将CD28z作为最优内域，并进入机制解析阶段。
第二环节发现，相比41BBz和其他设计，CD28z CAR-iNKT表面PLXND1表达显著升高。使用PLXND1阻断抗体可剂量依赖性地降低CD28z CAR-iNKT的亲合力，而对41BBz CAR-iNKT无影响。骨髓瘤细胞中SEMA4A表达最高，而SEMA3E不表达。CRISPR/Cas9敲除SEMA4A后，CD28z CAR-iNKT的亲合力降至与41BBz相当，而过表达PLXND1可提高BCMA CAR-T和BCMA 41BBz CAR-iNKT的亲合力至CD28z CAR-iNKT水平。这些结果表明PLXND1-SEMA4A轴是决定CD28z CAR-iNKT高亲合力的关键机制。体内实验进一步证实，CD28z CAR-iNKT在系统性骨髓瘤模型中的肿瘤控制能力和生存延长均优于其他设计；PLXND1阻断可削弱其体内抗肿瘤作用。此外，CD28z CAR-iNKT在体内外均优于其CAR-T对应物，提示iNKT平台在MM中的优势。
第三环节的结果显示，双价BINTE特异性结合iNKT而不结合普通T细胞，且其与可溶性BCMA和骨髓瘤细胞的结合亲和力高于单价形式。双价BINTE在体外可选择性杀伤骨髓瘤细胞，且其作用依赖于iNKT和BCMA表达。对MM患者原代骨髓细胞的研究表明，BINTE剂量依赖性地减少骨髓瘤浆细胞频率，而对非骨髓瘤骨髓细胞影响较小。在皮下和系统性骨髓瘤模型中，BINTE与体外扩增的iNKT联合可显著延缓肿瘤生长并延长生存，而单独使用BINTE或iNKT无效。虽然BCMA BINTE联合iNKT的整体疗效略低于BCMA CAR-iNKT，但其已表现出相当的抗骨髓瘤潜力，为后续联合治疗奠定了基础。
第四环节中，联合FCRL5 CAR-iNKT与BCMA BINTE的双靶点策略显著延缓了混合抗原骨髓瘤模型的疾病进展，并改善了总生存。流式分析显示，联合组骨髓和脾脏中FCRL5⁻与FCRL5⁺骨髓瘤细胞比例显著高于单独CAR-iNKT组，说明BINTE有效限制了CAR靶抗原阴性肿瘤细胞的免疫逃逸。同时，联合组总体肿瘤负荷也低于单用CAR-iNKT组。该结果证明了双靶点、双模态iNKT免疫治疗的可行性。
五、研究结论及意义
本研究得出以下结论：第一，在MM的CAR-iNKT治疗中，CD28z共刺激内域优于41BBz、OX40z以及第三代组合设计，其优势主要源于更高的细胞亲合力和增殖能力；第二，CD28z CAR-iNKT的高亲合力由PLXND1与骨髓瘤细胞表面SEMA4A的相互作用介导；第三，新开发的靶向TCRVβ11和BCMA的双价iNKT特异性衔接器具有显著抗骨髓瘤活性；第四，FCRL5 CAR-iNKT联合BCMA BINTE的双靶点策略可增强抗肿瘤疗效并限制抗原阴性肿瘤的免疫逃逸。
在科学价值上，本研究首次系统揭示了PLXND1-SEMA4A轴在CAR-iNKT免疫功能中的新机制，拓展了免疫细胞与肿瘤细胞相互作用的认知。在应用价值上，该研究为MM的“现货型”iNKT细胞治疗提供了优化方案，并提出了CAR-iNKT联合iNKT衔接器的模块化双靶点策略。尤其值得注意的是，FCRL5与SEMA4A均是位于染色体1q的基因，在伴有1q扩增（chr1q-amp）的高危骨髓瘤细胞中高表达，因此该策略可能对此类高危患者具有特殊优势。
六、研究亮点
本研究的亮点包括：第一，首次系统比较了五种不同共刺激内域在CAR-iNKT治疗MM中的功能差异，并确立了CD28z的优势地位；第二，发现并验证了PLXND1-SEMA4A相互作用作为CAR-iNKT亲合力调控的新型分子机制，且该机制独立于CAR靶点和scFv；第三，开发了靶向TCRVβ11的iNKT特异性双特异性衔接器，该设计保留了iTCR与CD1d结合的能力，从而不干扰iNKT的天然抗肿瘤通路；第四，创新性地将双靶点CAR-iNKT与BINTE结合，证明双模态免疫治疗可有效限制抗原逃逸；第五，利用声学力和剪切应力等生物物理亲合力检测技术，为CAR免疫细胞的临床前评估提供了更接近体内力学环境的预测指标。