类型a：学术研究报告

研究团队与发表信息
本研究的通讯作者为西北工业大学的Wanhe Wang与Jing Wang，第一作者为Xueliang Wang。合作单位包括西北工业大学西安干细胞与再生医学重点实验室、上海协同创新中心、深圳西北工业大学研究院及重庆西北工业大学技术创新中心。研究成果发表于Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy期刊，2023年5月18日在线发表，卷299，文章编号122884。

学术背景与研究目的
RNA-蛋白质相互作用（RNA-protein interactions, RPIs）在基因转录与蛋白质表达中起核心作用，但现有分析方法（如CLIP-seq、质谱联用等）需对RNA或蛋白进行标记，可能破坏相互作用完整性。本研究旨在开发一种基于CRISPR/Cas12a系统的非标记、荧光检测方法，直接分析RPIs。以血管内皮生长因子165（VEGF165）与其RNA适配体的相互作用为模型，通过CRISPR/Cas12a的RNA引导特性，实现高灵敏度、高选择性检测。

研究流程与方法
1. 原理设计
- 双功能RNA设计：crRNA同时作为VEGF165的RNA适配体与CRISPR/Cas12a系统的引导RNA。VEGF165结合crRNA后，阻碍Cas12a-crRNA-DNA三元复合物形成，导致荧光信号降低。
- 信号报告系统：使用ssDNA荧光报告探针（FAM-TTTTTT-BHQ1），Cas12a的trans-cleavage活性可切割探针释放荧光信号。

1. 实验优化

   • 反应条件：通过对比不同温度（20–42°C）、时间（10–80分钟）及crRNA:Cas12a比例（0.2:1至1.2:1），确定最佳条件为20°C孵育60分钟，crRNA:Cas12a=1:1。
     
   • 金属离子影响：测试Mg²⁺、Mn²⁺、Zn²⁺、Ca²⁺对Cas12a活性的影响，发现5 mM Mg²⁺可稳定三元复合物。
     

2. 灵敏度与特异性验证

   • 线性范围与检测限：VEGF165浓度1.0–1.0×10⁴ pg/mL范围内呈线性关系，检测限达0.23 pg/mL（3δ/slope）。
     
   • 特异性测试：对比BSA、溶菌酶、PSA等干扰蛋白，仅VEGF165（1.0 ng/mL）引起显著荧光降低，证明高特异性。
     

3. 实际样本检测

   • 血清样本回收率：在2.5%与5%牛血清中添加VEGF165（5.0–1000.0 pg/mL），回收率95.6%–108.8%，RSD为0.4%–13.1%，表明方法适用于复杂基质。
     

主要结果
1. 可行性验证：荧光光谱显示VEGF165存在时信号显著降低（图1a），证实竞争结合机制有效。
2. 优化结果：Mg²⁺浓度高于5 mM时抑制Cas12a活性（图2b），而20°C下孵育60分钟为最佳条件（图1c-e）。
3. 性能指标：检测限低于多数现有VEGF165生物传感器（表S1），且无需核酸扩增或标记步骤。

研究结论与价值
1. 科学价值：首次将CRISPR/Cas12a系统用于RPIs直接检测，提出“RNA双功能”设计理念，为研究RPIs提供了非侵入性工具。
2. 应用潜力：可推广至其他RPIs分析（如疾病相关RNA-蛋白复合物），并为CRISPR系统在非核酸靶标检测中开辟新路径。

研究亮点
1. 方法创新：无需RNA/蛋白标记，简化操作流程（120分钟内完成）。
2. 高灵敏度与选择性：检测限达亚pg/mL级别，且在血清中表现稳定。
3. 通用性：通过更换RNA适配体序列，可适配多种RPIs研究。

其他价值
研究得到国家自然科学基金（22101230）、陕西省基础研究计划（2021JQ-089）等资助，凸显其学术与临床转化潜力。