本次为您介绍的是一项发表于《Immunity》期刊的研究工作。这项研究由美国宾夕法尼亚大学Perelman医学院的Omkar U. Kawalekar、Roddy S. O‘Connor、Carl H. June等多位学者合作完成，并于2016年2月16日发表。这项研究的核心在于深入探究了嵌合抗原受体（Chimeric Antigen Receptor， CAR）T细胞疗法中，不同共刺激信号域（特别是CD28和4-1BB）如何通过重编程T细胞的代谢途径，从而影响其分化命运、持久性和抗肿瘤效能。
在学术背景方面，该研究扎根于肿瘤免疫治疗领域，尤其是近年来取得突破性进展的CAR-T细胞疗法。CAR-T细胞通过基因工程将识别肿瘤抗原的抗体片段与T细胞的激活信号域融合，能够特异性地杀伤肿瘤细胞，在治疗B细胞恶性肿瘤等方面展现出巨大潜力。然而，尽管CAR-T疗法已进入临床，但对于其核心组件——特别是不同共刺激信号域（如CD28和4-1BB）——如何具体影响T细胞的功能、持久性和抵抗耗竭的能力，其分子机制尚不明确。临床观察发现，含有4-1BB信号域的CAR-T细胞（例如在慢性淋巴细胞白血病治疗中）可能比含有CD28信号域的CAR-T细胞具有更长的体内持久性。已知内源性的CD28和4-1BB信号通路在T细胞中本就不同：CD28信号主要激活PI3K-AKT通路，促进糖酵解；而4-1BB信号则与T细胞的长期存活有关。因此，本研究旨在揭示，当这些信号域被整合到CAR结构中后，它们是否以及如何“重编程”CAR-T细胞的代谢状态，进而解释其在临床中表现差异的潜在机制。研究的目标是系统比较含有CD28或4-1BB信号域的CAR-T细胞在代谢特征、分化状态和持久性方面的差异，为未来设计更优的CAR结构提供理论基础。
研究的详细工作流程严谨而系统，主要包括以下几个步骤：
首先，研究者构建并表达了两组不同的CAR分子。他们选择了针对CD19和间皮素（mesothelin）两种抗原的CAR，每种CAR又分别构建了包含CD28-CD3ζ（简称28z）或4-1BB-CD3ζ（简称BBz）信号域的版本。为了精确研究CAR信号本身，避免内源性T细胞受体（TCR）激活的干扰，他们采用了一种优化的电穿孔技术，将体外转录的CAR mRNA直接导入未经预激活的人原代T细胞中。这种方法使得超过90%的CD4+和CD8+ T细胞都能高表达CAR，且两种CAR的表达水平相当，确保了实验的起点一致性。这是一种关键的技术优化，它排除了传统病毒转导需伴随TCR激活所带来的混杂信号，使得CAR特异性信号的影响得以被单独剖析。
其次，在体外功能与表型分析阶段，研究者在CAR-T细胞表达后，使用包被了相应抗独特型抗体或重组抗原的磁珠进行特异性刺激，模拟体内遭遇肿瘤抗原的过程。他们系统地监测了细胞的增殖、存活和分化表型。增殖实验显示，无论在CD4+还是CD8+ T细胞中，BBz CAR-T细胞均表现出比28z CAR-T细胞更强的扩增能力和更长的体外持久性，培养时间可超过4周，而28z CAR-T细胞的增殖期通常限于14天左右。通过流式细胞术分析记忆亚群标志物（CCR7和CD45RO），他们发现，随着时间的推移，BBz CAR-T细胞群体中中央记忆型T细胞（TCM， CCR7+CD45RO+）的比例显著富集；而28z CAR-T细胞则倾向于产生更多的效应记忆型T细胞（TEM， CCR7-CD45RO+）。这为BBz CAR-T细胞更强的持久性提供了一种表型上的解释。
第三，代谢特征分析是本研究的核心环节。研究者使用了海马（Seahorse）细胞能量代谢分析仪，实时测量了细胞的耗氧率（OCR，反映线粒体氧化磷酸化水平）和细胞外酸化率（ECAR，反映糖酵解水平）。结果显示，在抗原刺激后，两种CAR-T细胞的基线OCR均有所上升，但BBz CAR-T细胞的最大呼吸容量显著高于28z CAR-T细胞，尤其是在刺激后第7天和第21天。相反，28z CAR-T细胞的ECAR水平在同期显著高于BBz CAR-T细胞。这些数据初步表明，BBz CAR-T细胞更依赖于氧化代谢，而28z CAR-T细胞更依赖于糖酵解。为了更精确地分析，研究者甚至进一步分选了不同记忆表型的细胞亚群进行代谢通量分析，发现BBz组中的TCM和初始样T细胞亚群具有更高的OCR，而28z组中各亚群的ECAR普遍更高。这直接将特定的CAR信号、细胞分化状态和代谢特征联系了起来。
第四，为了深入探究代谢差异的分子基础，研究者进行了基因表达和代谢物分析。他们通过qRT-PCR检测了与糖代谢和脂代谢相关的一系列基因。结果显示，28z CAR-T细胞中葡萄糖转运蛋白GLUT1、丙酮酸脱氢酶激酶1（PDK1）等糖酵解相关基因的表达显著上调。而BBz CAR-T细胞中，负责脂肪酸氧化（FAO）限速步骤的肉毒碱棕榈酰转移酶1A（CPT1A）和脂肪酸结合蛋白5（FABP5）的mRNA水平则显著更高。功能实验进一步证实了这些差异：28z CAR-T细胞消耗培养基中葡萄糖和产生乳酸的速度更快；而使用稳定同位素标记的棕榈酸示踪实验表明，BBz CAR-T细胞对脂肪酸的摄取和氧化分解更为活跃。
第五，研究者将目光投向线粒体本身。他们发现BBz CAR-T细胞不仅氧化代谢更强，其线粒体储备呼吸容量（SRC）也更高，这是一个与细胞应对压力和环境挑战能力相关的重要指标。通过透射电镜和共聚焦显微镜观察，他们发现抗原刺激后第14天和第21天，BBz CAR-T细胞内的线粒体质量和密度均显著高于28z CAR-T细胞，即发生了线粒体生物合成增强。基因分析显示，BBz CAR-T细胞中与线粒体生物合成和功能相关的关键转录因子，如核呼吸因子1（NRF1）、GA结合蛋白（NRF2），以及线粒体转录因子A（TFAM）和线粒体编码的细胞色素C氧化酶亚基1（mtCO-1）的表达均上调。这阐明了BBz信号域通过激活特定的转录程序，驱动线粒体生物合成，从而赋予细胞强大氧化代谢能力的完整通路。
该研究取得了一系列重要的结果，并环环相扣地支持了其最终结论。初始的增殖与表型分析结果表明，BBz CAR-T细胞具有体外持久性优势，且伴随TCM亚群的富集，这提出了“为何不同”的问题。随后的代谢通量分析提供了第一个关键答案：两者采用了截然不同的能量代谢模式。这一发现自然引出了下一个问题：这种代谢差异的分子体现是什么？基因表达和代谢物分析结果明确指出，28z CAR-T细胞偏向糖酵解基因程序和快速葡萄糖利用，而BBz CAR-T细胞则上调了脂肪酸氧化相关基因并实际更多地利用脂肪酸。那么，BBz CAR-T细胞强大的氧化代谢能力其结构基础何在？线粒体形态学和功能学研究给出了答案：BBz信号诱导了线粒体生物合成，增加了线粒体质量和功能储备。最终，线粒体生物合成相关基因的上调结果，将CAR的信号传递（4-1BB域）与核基因编程、细胞器重塑和最终的表型输出（中央记忆分化与持久性）串联成了一条清晰的因果链。每一个环节的结果都为下一个探究方向提供了逻辑依据和数据支撑，共同构建了一个完整的故事线。
本研究得出的核心结论是：CAR结构中的共刺激信号域（CD28 vs. 4-1BB）能够对T细胞进行截然不同的代谢重编程。CD28信号域驱使T细胞走向效应记忆表型，其主要代谢特征为增强的糖酵解；而4-1BB信号域则促进中央记忆表型分化，通过诱导线粒体生物合成和增强脂肪酸氧化，赋予T细胞更强的氧化代谢能力和持久性。这一发现从代谢角度，至少部分地解释了临床上含有4-1BB信号域的CAR-T细胞（如用于CLL的CAR-T）可能具有更长持久性的现象。
本研究的科学价值与应用意义重大。在科学层面，它首次系统地揭示了CAR信号域可以直接决定T细胞的代谢命运，并将合成生物学（CAR设计）、免疫学（T细胞分化）和代谢学（能量代谢途径）紧密地联系起来，深化了我们对工程化T细胞功能调控的理解。在应用层面，这项研究为“按需定制”CAR-T细胞提供了理论蓝图：如果治疗需要快速、强大的短期杀伤效应（例如针对某些易引起脱靶毒性的靶点），采用偏向CD28信号域的设计可能更合适；如果治疗目标是获得长期免疫监视和防止复发，那么含有4-1BB信号域的设计可能是更优选择。研究甚至提出了联合使用不同信号域CAR-T细胞的策略，以模拟天然免疫反应中效应期和记忆期的更迭，从而可能获得更佳疗效。此外，该发现对设计抵抗肿瘤微环境耗竭、具有更强生存能力的工程化T细胞（包括CAR-T和Treg等）具有重要的指导意义。
本研究的亮点在于：第一，重要的科学发现：清晰阐明了CD28和4-1BB信号域通过代谢重编程影响CAR-T细胞命运的新机制。第二，新颖的实验方法：采用mRNA电穿孔高表达CAR于静息T细胞，避免了传统方法的TCR共激活干扰，实现了对CAR特异性信号的精确研究。第三，系统性的研究深度：从细胞表型、功能、到实时代谢、基因表达、代谢物分析，再到亚细胞器（线粒体）的形态与功能，构建了多层次、完整的证据链。第四，明确的临床转化启示：研究结果直接对应于临床观察到的差异，并为未来的CAR设计提供了坚实的理论和实验依据。这项工作不仅是基础研究的典范，也是转化医学的桥梁，深刻影响了后续CAR-T细胞疗法的研发思路。