CRISPR/甲氨蝶呤整合策略降低TCR-T细胞工程中染色体14丢失的学术研究报告
一、主要作者与机构
本研究由上海交通大学医学院附属上海第一人民医院血液科的Jian Xu、Lianghua Shen、Ziyu Chen等共同完成，通讯作者为Yan Zhang、Xianmin Song、Pengran Wang和Xiaorui Wang。研究团队还包括来自上海交通大学医学院动物核心设施、检验医学科等多个部门的合作者。论文于2025年12月发表于期刊 *Molecular Therapy: Methods & Clinical Development*（DOI: 10.1016/j.omtm.2025.101635）。
二、学术背景
科学领域：本研究属于肿瘤免疫治疗领域，聚焦于T细胞受体工程化T细胞（TCR-T）疗法的优化。
研究动机：传统的慢病毒（lentiviral, LV）转导TCR-T疗法存在插入突变风险，而CRISPR介导的T细胞受体α恒定区（T cell receptor α constant, TRAC）靶向编辑虽能避免随机整合，却面临敲入效率低和染色体14丢失的问题。染色体不稳定性可能引发长期安全性隐患，阻碍临床转化。
研究目标：开发一种非病毒策略，结合CRISPR-Cas9电转与甲氨蝶呤（methotrexate, MTX）代谢选择，实现高效、安全的TRAC位点靶向TCR整合，同时减少染色体异常。
三、研究流程与实验方法
1. 电转条件优化
- 研究对象：健康供体外周血来源的原代CD3+ T细胞（n≥3）。
- 关键步骤：
- 激活后24–72小时内电转CRISPR核糖核蛋白（ribonucleoprotein, RNP）和同源定向修复（homology-directed repair, HDR）模板。
- 比较不同缓冲液（商用P3 vs. 自研B1 mix）和电转程序（EO115 vs. EO138），发现B1 mix/EO138组合的HDR效率最高（20.13%±0.12%）。
- 引入截短Cas9靶序列（truncated Cas9 target sequence, TCTS）修饰的HDR模板和HDR增强剂V2（抑制非同源末端连接通路），使TCR初始整合效率提升至~20%。
MTX富集与染色体稳定性评估
功能验证
四、主要结果与逻辑关联
1. 效率优化：通过电转参数和HDR模板设计优化，首次实现原代T细胞中TCR的高效靶向整合（~20%），为后续MTX富集奠定基础。
2. 安全性提升：MTX选择不仅提高产物纯度，还通过清除染色体异常克隆，将染色体14丢失率降至基线水平，解决了CRISPR编辑的关键安全隐患。
3. 功能优势：TRAC-TCR-T细胞的细胞因子分泌谱和转录组特征显示其抗肿瘤活性更持久，且避免了病毒载体的插入突变风险。
五、研究结论与价值
科学意义：
- 首次将CRISPR编辑与代谢选择整合，同步解决效率与基因组稳定性问题，为TCR-T疗法提供了“双保险”策略。
- 揭示了TRAC位点编辑中染色体丢失的机制，并提出MTX富集的解决方案。
应用价值：
- 该平台符合良好生产规范（good manufacturing practice, GMP），可直接转化至临床级生产。
- 为非病毒CAR-T/TCR-T疗法开发提供了通用技术框架。
六、研究亮点
1. 方法创新：结合CRISPR-RNP电转与MTX选择，实现高效、安全的非病毒T细胞工程。
2. 安全性突破：首次通过药理富集降低CRISPR相关的染色体异常，为临床转化扫除障碍。
3. 功能验证全面：从分子机制（FISH）、体外功能（细胞因子分泌）到体内疗效（异种移植模型）多层面验证策略可行性。
七、其他价值
研究还发现，TRAC启动子驱动的TCR表达比病毒载体更稳定（变异系数更低），提示内源调控可改善治疗产品的批次一致性。此外，MTX作为已获批药物，其临床应用安全性为未来转化提供了便利。
（注：专业术语如“同源定向修复（HDR）”“荧光原位杂交（FISH）”等在首次出现时标注英文原文。）