关于“暴露的磷脂酰丝氨酸是T细胞耗竭中的一种抑制性分子”研究的学术报告
本研究由Rafi Ahmed（通讯作者）领衔，联合来自埃默里大学医学院、杰克逊实验室基因组医学中心、德克萨斯大学西南医学中心、丹娜-法伯癌症研究所、哈佛医学院以及康涅狄格大学等多个机构的科研团队共同完成。研究成果以题为《Exposed phosphatidylserine is an inhibitory molecule in T cell exhaustion》的论文形式，于2026年（在线发表日期）发表在顶级学术期刊《Nature》上。
一、 学术背景 本研究属于免疫学，特别是T细胞生物学和肿瘤免疫学领域。在癌症和慢性感染中，CD8+ T细胞会进入一种功能失调的状态，称为“耗竭”（exhaustion）。其经典特征是表达多种抑制性受体，如PD-1、TIM-3、LAG-3等。长期以来，对耗竭T细胞抑制机制的研究焦点几乎完全集中在细胞表面蛋白上。然而，细胞表面代谢物是否也参与这一过程尚不清楚。
磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）是一种重要的膜磷脂。在活细胞中，PS通常位于细胞膜的内侧。然而，在细胞凋亡过程中，PS会外翻（externalize）到细胞膜外侧，作为“吃掉我”（eat-me）的信号，引导巨噬细胞等清除死亡细胞，并在此过程中发挥抑制炎症反应的作用。近期研究发现，一些活细胞（如活化的肿瘤血管内皮和癌细胞）也能在未死亡的情况下外露PS。此外，有零星报道称活化的T细胞也能外露PS，但其在慢性抗原刺激导致的CD8+ T细胞耗竭中的具体作用和机制，人们知之甚少。因此，本研究旨在系统探究PS在CD8+ T细胞耗竭中的作用，阐明其作为一种“非经典”细胞表面抑制性分子的机制，并探索靶向PS的潜在治疗价值。
二、 详细研究流程 本研究流程严谨，综合运用了体内模型、体外实验、多组学分析和临床样本验证等多种手段。
1. 确认抗原特异性耗竭CD8+ T细胞在体内外露PS * 研究对象与样本量：使用慢性淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒克隆13（LCMV Cl.13）感染小鼠作为慢性感染/耗竭模型，以急性LCMV Armstrong感染作为对照。在不同时间点（如感染后第8、45、60天等）采集脾脏、肝脏、肺脏等组织，分离淋巴细胞进行分析，每组通常包含3-7只或更多小鼠。 * 实验方法：利用荧光标记的膜联蛋白V（Annexin V，能特异性结合暴露的PS）通过流式细胞术检测病毒特异性（使用MHC-I四聚体染色，如D*bGP33+或D*bGP276+）CD8+ T细胞表面的PS。同时，使用非荧光Annexin V进行阻断实验，以及使用其他PS结合蛋白（MFG-E8）和靶向PS的抗体（1N11）进行验证，以确保检测的特异性。 * 数据分析：通过平均荧光强度（MFI）定量PS暴露水平，比较不同感染阶段、不同组织来源、以及耗竭T细胞内部不同亚群（干样细胞PD1+TCF1+、过渡细胞PD1+TIM3+CD101-、终末分化细胞PD1+TIM3+CD101+）之间的差异。 * 排除细胞死亡干扰：通过活/死染料排除死细胞；检测凋亡标志物（如活化的caspase-3、钙网蛋白）；对PS+ PD1+ CD8+ T细胞进行过继回输，验证其在体内的存活与扩增能力；以及进行体外吞噬实验，证明巨噬细胞能有效吞噬凋亡的CD8+ T细胞，但不吞噬PS外露的活耗竭T细胞。
2. 探究耗竭T细胞的PS代谢特征 * 研究对象：分选慢性感染小鼠脾脏中的PD1+ CD8+ T细胞各亚群（干样、过渡、终末分化）以及对照的初始CD8+ T细胞。 * 实验方法： * 转录组学：对分选的细胞进行RNA测序（RNA-seq），分析PS代谢相关通路的基因集富集情况。 * 脂质组学：采用优化的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）方法，对分选的细胞进行靶向脂质组学分析，鉴定并定量细胞内的各种PS分子种类。 * 流式细胞内染色：通过固定破膜后染色，检测细胞内总PS水平。 * 数据分析：基因集富集分析（GSEA）比较不同细胞亚群PS代谢通路的活性；主成分分析（PCA）和热图展示脂质组学数据的聚类和差异PS分子；统计不同亚群总PS含量的变化。
3. 评估靶向暴露PS在慢性感染中的功能 * 研究对象：慢性LCMV Cl.13感染小鼠（感染>45天后）。 * 实验方法： * 体内抗体治疗：使用靶向PS的抗体（mCh1N11）对小鼠进行为期两周的治疗（每3天腹腔注射一次），对照组使用同型对照IgG。 * 效应评估：治疗结束后，通过流式细胞术计数脾脏、肝脏、肺和外周血中病毒特异性PD1+ CD8+ T细胞及其各亚群的绝对数量。 * 转录组变化分析：分选治疗组和对照组小鼠的PD1+ CD8+ T细胞各亚群，进行RNA-seq，分析抗体治疗引起的转录组变化，特别是与增殖、分化和静息相关的基因模块。 * 过继转移验证：分选供体小鼠（CD45.2）的PD1+干样细胞或TIM3+效应细胞，过继转移至感染背景匹配的受体小鼠（CD45.1），然后对受体进行PS靶向抗体或对照治疗，追踪供体细胞的扩增和命运。 * 数据分析：比较治疗组与对照组之间T细胞数量和表型的变化；通过GSEA分析差异表达的基因通路；统计过继转移后供体细胞的扩增倍数。
4. 阐明暴露PS的作用机制（抑制性CD8-DC相互作用） * 研究对象：慢性感染小鼠的脾脏免疫细胞。 * 实验方法： * 单细胞RNA测序：对PS靶向抗体或对照治疗后的小鼠，分选脾脏中髓系/抗原呈递细胞（APC）富集的群体（CD45+，排除T、B、NK细胞），进行单细胞RNA测序（scRNA-seq）。 * 流式验证：分析治疗后树突状细胞（DC）上共刺激分子（如CD86）和抗原呈递相关分子的表达变化。 * 体外共培养实验：分选慢性感染小鼠的PS+ PD1+ CD8+ T细胞和CD11c+ MHC-II+ DC。将T细胞与DC共培养，并加入PS靶向抗体或对照，24小时后检测DC上CD86的表达。另外，用细胞示踪染料（CTV）标记分选的干样或TIM3+ CD8+ T细胞，与DC共培养72小时，分析T细胞的增殖情况。 * 数据分析：scRNA-seq数据用于聚类分析DC等髓系细胞亚群，并鉴定治疗前后各亚群的差异表达基因（DEGs）和相关通路富集。流式数据定量DC激活标志物的变化和T细胞增殖指数。
5. 探索PS靶向疗法与现有免疫疗法的协同效应 * 研究对象：慢性LCMV Cl.13感染小鼠。 * 实验方法：设立四组治疗：对照IgG、单独PS靶向抗体、单独抗PD-L1抗体、PS靶向抗体+抗PD-L1抗体联合治疗。治疗两周后，评估病毒特异性CD8+ T细胞反应的扩增程度（脾、肝、肺、血），并通过噬斑测定法检测各组织中的病毒滴度。 * 数据分析：比较各组T细胞扩增倍数和病毒清除效率的差异，评估协同效应。
6. 验证人类肿瘤CD8+ T细胞中PS暴露的保守性 * 研究对象：从透明细胞肾细胞癌（ccRCC）和非小细胞肺癌（NSCLC）患者手术切除的肿瘤组织中分离肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）。 * 实验方法：通过流式细胞术检测肿瘤内PD1+ CD8+ T细胞（及其干样PD1+CD39-和效应PD1+CD39+亚群）的PS暴露水平，并分析其与凋亡标志物（活化caspase-3）的关系。同时，利用已发表的单细胞RNA-seq数据，分析人肿瘤CD8+ TILs中PS代谢基因签名的富集情况。 * 数据分析：比较肿瘤内PD1+和PD1- CD8+ T细胞，以及PD1+内部不同亚群之间PS暴露水平的差异。
三、 主要研究结果 1. 活化的耗竭CD8+ T细胞持续性外露PS。 研究发现，在急性或慢性LCMV感染早期（如第8天），抗原特异性CD8+ T细胞均会外露PS，这是T细胞活化的一个早期事件。在急性感染中，随着抗原被清除，PS暴露水平逐渐下降。然而，在慢性感染中，耗竭的PD1+ CD8+ T细胞在整个感染过程中持续维持甚至增加PS的外露。重要的是，这些外露PS的T细胞是存活的（不表达凋亡标志物，可被过继回输并存活），且在所有耗竭亚群（干样、过渡、终末分化）中均有发现，但在分化程度更高的TIM3+效应亚群中外露水平更高。
2. 耗竭T细胞上调PS代谢并积累PS。 RNA-seq分析显示，慢性感染小鼠的耗竭CD8+ T细胞（尤其是各PD1+亚群）显著富集了PS代谢相关的基因签名，而上调PS合成酶、下调PS降解酶的表达。脂质组学分析证实，与初始T细胞相比，耗竭T细胞各亚群（从干样到终末分化）的总细胞PS含量逐渐增加，多种特定的PS分子种类显著上调。这一发现将细胞表面的PS暴露现象与细胞内部的脂质代谢重编程联系了起来。
3. 靶向暴露PS可扩增病毒特异性CD8+ T细胞反应，主要作用于干样细胞。 在慢性感染小鼠中使用PS靶向抗体（mCh1N11）治疗两周后，脾脏、肝脏和血液中的总PD1+及病毒特异性CD8+ T细胞数量显著增加。深入分析发现，所有耗竭亚群（干样、过渡、终末分化）的细胞绝对数量均有增加。RNA-seq和过继转移实验揭示了关键机制：PS靶向治疗最主要的效应靶点是PD1+TCF1+干样细胞。治疗打破了干样细胞的静息状态，使其与增殖（如MYC靶标、E2F靶标）、细胞周期相关的基因模块上调，Ki67表达增加，自我更新和向效应细胞分化的能力增强。而TIM3+效应细胞对治疗的增殖反应较弱。
4. 暴露的PS通过抑制树突状细胞功能来间接调控T细胞反应。 scRNA-seq分析发现，PS靶向治疗后，脾脏中的DC（特别是XCR1+的1型经典DC，即cDC1）在转录水平上表现出抗原呈递和T细胞激活相关通路的显著上调。流式细胞术验证显示，治疗后DC表面的关键共刺激分子CD86表达增加。体外共培养实验直接证明：当PS+ PD1+ CD8+ T细胞与DC共育时，加入PS靶向抗体可以阻断PS的抑制作用，从而提升DC的CD86表达水平，并进而显著促进共培养体系中干样CD8+ T细胞的增殖。这表明，耗竭T细胞表面的PS作为一种外源性抑制配体，通过与DC上未知的PS识别受体相互作用，抑制了DC的免疫刺激功能，从而形成了一个限制T细胞活化的负反馈环。
5. PS靶向疗法与PD-1/PD-L1阻断疗法具有协同作用。 在慢性感染模型中，单独使用PS靶向抗体能扩增T细胞但未能有效降低病毒载量。单独使用抗PD-L1抗体可降低病毒载量。然而，两者联合治疗产生了最显著的协同效应：不仅病毒特异性CD8+ T细胞反应得到最大程度的扩增（尤其在效应细胞亚群），而且各组织中的病毒滴度也降至最低。这提示，同时靶向抑制性DC轴（PS）和抑制性T细胞轴（PD-1）能更有效地恢复抗病毒免疫。
6. PS暴露在人类肿瘤耗竭CD8+ T细胞中保守存在。 在ccRCC和NSCLC患者的肿瘤浸润CD8+ T细胞中，PD1+细胞亚群同样表现出显著的PS外露，且这一现象与细胞凋亡无关。与人鼠模型一致，肿瘤内更具效应表型的PD1+CD39+ T细胞比干样表型的PD1+CD39- T细胞外露更多的PS。转录组数据也显示这些细胞富含PS代谢基因签名。
四、 研究结论与意义 本研究系统性地揭示并阐明了一个先前未被重视的免疫调节机制：在慢性抗原刺激下，完全存活的、耗竭的CD8+ T细胞会持续性外露膜磷脂PS。这种PS暴露不仅是一个伴随现象，更作为一种功能性的、“非经典”的细胞表面抑制性分子，通过抑制抗原呈递细胞（特别是DC）的免疫刺激功能，来间接维持耗竭T细胞（尤其是干样细胞）的静息状态，从而限制抗病毒/抗肿瘤免疫反应。靶向这一免疫抑制性脂质，可以打破这种抑制性相互作用，促进耗竭T细胞，特别是具有再生潜能的干样细胞的增殖和分化。
科学价值：这项研究极大地拓展了我们对T细胞耗竭机制的理解，将视野从传统的抑制性受体蛋白延伸到了细胞表面代谢物（脂质）领域。它揭示了免疫细胞代谢产物可以作为一种新型的细胞间通讯信号，在免疫调节中发挥关键作用。同时，研究深化了对耗竭T细胞干性维持微环境（特别是CD8-DC相互作用）的理解。
应用价值：研究为肿瘤和慢性感染性疾病的免疫治疗提供了新的潜在靶点和策略。靶向PS的抗体（如文中使用的mCh1N11及其临床对应物Bavituximab）与现有PD-1/PD-L1阻断疗法的协同效应，在临床前模型中得到了验证，为这种联合疗法在临床试验（如已在肝细胞癌中进行的试验）中的应用提供了强有力的理论依据和机制阐释。它提示，同时干预抑制性APC轴和抑制性T细胞轴可能是一种更有效的免疫治疗策略。
五、 研究亮点 1. 重要发现：首次系统证明活体耗竭CD8+ T细胞外露PS是一种普遍的、保守的生物学现象，并阐明其作为功能性抑制分子的全新角色。 2. 机制新颖：创新性地提出了“耗竭T细胞-PS-抑制DC功能”这一外源性免疫抑制轴，为理解耗竭微环境提供了新视角。 3. 方法全面：研究采用了从动物模型到人类样本、从表型分析到多组学（转录组、脂质组、单细胞转录组）、从体内功能实验到体外机制探究的完整技术链条，论证扎实。 4. 转化潜力明确：不仅阐明了基础生物学机制，还直接验证了靶向PS的治疗潜力及其与现有免疫检查点抑制剂的协同效应，具有明确的临床转化指导意义。 5. 概念拓展：将“免疫检查点”的概念从蛋白质扩展到脂质代谢物，开启了免疫代谢调控研究的新维度。