单细胞多组学整合分析揭示前列腺癌异质性研究学术报告

一、 研究团队、发表期刊与时间 本研究的核心作者包括Xiaojie Bian、Wenfeng Wang、Mierxiati Abudurexiti、Xingming Zhang、Weiwei Ma、Guohai Shi、Leilei Du、Midie Xu、Xin Wang、Cong Tan、Hui Sun、Xiadi He、Chenyue Zhang、Yao Zhu、Min Zhang、Dingwei Ye和Jianhua Wang。研究团队主要来自复旦大学附属肿瘤医院泌尿外科、复旦大学上海医学院肿瘤学系、复旦大学上海癌症研究所、上海泌尿肿瘤研究所，部分合作者来自美国哈佛医学院、达纳-法伯癌症研究所以及上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心。该项研究成果于2024年发表在学术期刊《Advanced Science》上（Adv. Sci. 2024, 11, 2305724）。

二、 学术背景与研究目的 本研究属于肿瘤学，特别是前列腺癌（Prostate Cancer, PCa）肿瘤微环境（Tumor Microenvironment, TME）与单细胞组学交叉领域。前列腺癌是一种具有高度异质性的疾病，其肿瘤微环境中包含复杂的细胞生态系统。然而，肿瘤细胞与基质细胞如何相互塑造这种异质性，反之亦然，目前尚不完全清楚。先前的研究虽然对前列腺癌的细胞组成有一定认识，但对于疾病进展过程中不同细胞亚群的具体动态变化、状态转换及其相互作用网络缺乏系统性的高分辨率解析。尤其是在雄激素剥夺疗法（Androgen-Drivation Therapy, ADT）等标准治疗压力下，肿瘤细胞如何演变、免疫微环境如何重塑，以及这些变化如何影响治疗反应和疾病复发，是亟待解决的关键科学问题。

因此，本研究旨在通过整合单细胞RNA测序（scRNA-seq）、空间转录组学（Spatial Transcriptomics）和批量ATAC-seq（Assay for Transposase-Accessible Chromatin with sequencing）等多组学技术，系统性地描绘前列腺癌在单细胞分辨率下的阶段特异性肿瘤微环境图谱。研究目标具体包括：1）解析前列腺癌上皮细胞的异质性及其在疾病进展（包括向神经内分泌分化）和ADT治疗下的谱系可塑性；2）刻画肿瘤浸润免疫细胞（特别是T细胞、巨噬细胞、中性粒细胞）的功能状态、动态变化及其与临床分期的关联；3）揭示癌症相关成纤维细胞（Cancer-Associated Fibroblasts, CAFs）的异质性及其在塑造免疫抑制微环境中的作用；4）阐明肿瘤微环境中不同细胞类型之间的相互作用网络，以期为前列腺癌的诊断和治疗提供新的见解和潜在靶点。

三、 详细研究流程与方法 本研究是一项综合性、多步骤的队列研究，其工作流程系统且严谨，主要包含以下几个核心环节：

1. 样本收集与处理： 研究团队收集了来自根治性前列腺切除术（Radical Prostatectomy, RP）标本的7例前列腺癌组织（包括1例神经内分泌前列腺癌NEPC，6例局限性前列腺癌）以及1例正常前列腺组织作为对照。所有样本均经过苏木精-伊红（H&E）染色和免疫组织化学（IHC）染色进行病理类型确认。关键的是，所有样本均配对进行了空间转录组学分析，实现了单细胞数据与空间位置信息的关联。

2. 单细胞RNA测序（scRNA-seq）与数据处理： 将前列腺组织样本解离成单细胞悬液后，使用10x Genomics Chromium平台构建单细胞5’基因表达文库，并在NovaSeq 6000平台上进行测序。原始数据使用Cell Ranger软件（v6.0.1）进行比对（参考基因组GRCh38/hg38）和定量，生成每个细胞的基因表达计数矩阵。质控标准严格：表达基因数少于100或多于7000的细胞，以及线粒体基因转录本比例高于15%的细胞被剔除。最终，共有77,661个高质量细胞通过质控并用于后续分析。数据处理和分析主要在R语言环境中使用Seurat套件（v3）完成，包括数据标准化、批次效应校正、主成分分析（PCA）、基于图的细胞聚类和细胞类型注释。细胞类型根据已知的标志基因进行鉴定，例如上皮细胞（KRT8, KRT18）、T细胞（CD3E, CD3D）、髓系细胞（CD14, CSF1R）等。

3. 空间转录组学分析： 使用10x Genomics Visium空间基因表达芯片对配对的组织切片进行空间转录组测序。为了在空间位置上解析细胞多样性，研究团队综合应用了机器学习算法（如XGBoost）和计算智能/深度学习框架（如TensorFlow 2）对空间转录组数据进行细胞类型反卷积（deconvolution）和原位细胞通讯分析，从而将单细胞聚类结果映射回组织原位，验证并拓展了细胞亚群的空间分布和相互作用模式。

4. 批量ATAC-seq分析： 为了研究疾病进展中染色质可及性的变化，研究团队对低级别和高级别格里森评分（Gleason Score, GS）的样本进行了批量ATAC-seq和批量RNA-seq。通过比对、峰值（peak）识别（使用MACS2软件），分析了全基因组范围内染色质开放区域的变化，特别关注了雄激素受体（AR）靶基因（如KLK2, KLK3, FKBP5）以及其他在前列腺癌中重要的基因位点（如KLK11, AMACR）的可及性差异，并与TCGA等公共数据库中的泛癌ATAC-seq数据进行了比较验证。

5. 生物信息学深度分析： 本研究进行了多层次、深入的生物信息学分析： * 上皮细胞异质性与进化轨迹分析： 对32,741个上皮细胞进行亚聚类，识别出11个亚群。使用“inferCNV”包评估单细胞水平的拷贝数变异（CNV），以区分肿瘤细胞和正常细胞。利用Monocle 2和Monocle 3软件包进行拟时序（pseudotime）分析，重建上皮细胞的发育和分化轨迹，识别关键的过渡状态细胞（如Club细胞）。 * 免疫与基质细胞亚群解析： 对T细胞、髓系细胞（巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞）、中性粒细胞和成纤维细胞分别进行重新聚类，鉴定具有不同功能状态的亚群（如CD8+CXCR6+ T细胞、TAM-macro-2巨噬细胞、活化/失能中性粒细胞、FAP+成纤维细胞等）。 * 转录因子调控网络分析： 使用SCENIC（Single-Cell Regulatory Network Inference and Clustering）分析来推断驱动不同细胞状态（特别是上皮细胞状态转换）的关键转录因子（如SOX9, KLF5, MYC）。 * 细胞间通讯分析： 使用CellChat软件包系统地分析了肿瘤微环境中不同细胞类型之间的配体-受体相互作用，揭示了关键的信号通路（如MHC-I、C型凝集素、TIGIT、TGF-β通路）。 * 功能富集与生存分析： 对差异表达基因进行基因本体（GO）和通路富集分析（使用Metascape在线工具）。利用TCGA等公共数据库，分析关键基因标记物与患者预后（总生存期OS、无病生存期DFS、无进展间期PFI）的关联。

6. 实验验证： 为了验证生物信息学发现的生物学功能，研究团队进行了多项体外和体内实验： * 细胞功能实验： 在前列腺癌细胞系22Rv1和正常前列腺上皮细胞系RWPE-1中过表达转录因子SOX9或KLF5，通过Western Blot检测下游蛋白（KRT13, Wnt/β-catenin通路相关蛋白）表达，通过CCK-8实验检测细胞生长，并通过免疫细胞化学观察β-catenin的核转位。通过染色质免疫沉淀（ChIP）-PCR和ChIP-seq验证SOX9/KLF5对CTNNB1（β-catenin基因）的直接靶向作用。 * 免疫荧光与免疫组化验证： 在独立的人类前列腺癌组织芯片上，使用免疫荧光（IF）和免疫组化（IHC）验证关键细胞亚群（如SOX9high Club细胞、CD8+CXCR6+ T细胞、CD68+CD86-巨噬细胞、FAP+成纤维细胞、FOXP3+调节性T细胞Tregs）的存在、丰度变化及空间共定位关系。 * 流式细胞术验证： 从新鲜前列腺癌组织中分离细胞，通过流式细胞术验证CD8+CXCR6+ T细胞在刺激后分泌颗粒酶B（GZMB）和穿孔素（PRF1）的能力强于CD8+CXCR6- T细胞。 * 小鼠模型与共培养实验： 利用条件性基因敲除小鼠模型（DKO: Pb-Cre; Ptenflox/flox; Hic1flox/flox 与对照 Ctrl: Pb-Cre; Ptenflox/flox），分离肿瘤相关成纤维细胞（CAFs）并与从脾脏分离的CD4+ T细胞共培养。通过流式细胞术证明，来自DKO小鼠（模拟晚期/神经内分泌表型）的CAFs比来自对照小鼠的CAFs能诱导更多的CD4+FOXP3+ Tregs分化，从而验证了FAP+成纤维细胞的免疫抑制功能。

四、 主要研究结果 1. 上皮细胞异质性、谱系可塑性与ADT耐药： * 鉴定出具有干细胞特性的SOX9highARlow Club细胞亚群： 单细胞分析揭示了前列腺上皮的高度异质性。拟时序分析发现，一类标记为PIGR、SCGB3A1的Club细胞位于正常管腔细胞向癌症细胞分化的分支点上。进一步细分发现，其中SOX9高表达、AR低表达的Club细胞亚群（Club cell 1）在经历新辅助ADT治疗的患者（PCA-4）中显著富集。IHC染色证实，ADT治疗后残留的形态学“正常”细胞高表达MMP7和LTF（Club细胞标志物），且AR阴性，其比例随ADT暴露时间增加而显著上升。 * SOX9/KLF5驱动Wnt/β-catenin通路激活： SCENIC和拟时序分析表明，SOX9和KLF5是驱动正常管腔细胞去分化为癌症干细胞样状态的关键转录因子。功能实验证实，过表达SOX9或KLF5能激活Wnt/β-catenin通路，并上调干细胞标志物KRT13。ChIP实验证明CTNNB1（β-catenin）是SOX9和KLF5的直接靶基因。这表明ADT后残留的SOX9high Club细胞通过激活Wnt/β-catenin通路获得干细胞样状态，可能是前列腺癌生化复发的一个细胞起源。 * 发现新的CRPC标志物KLK12： 研究鉴定出KLK12（激肽释放酶家族成员）在去势抵抗性前列腺癌（CRPC）上皮细胞中特异性高表达，而在激素敏感性前列腺癌（HSPC）中几乎不表达，IHC验证了其在CRPC患者中的阳性率（8/10），提示其可作为CRPC的潜在生物标志物。

2. 肿瘤浸润淋巴细胞：效应性CD8+ T细胞的丧失 * 鉴定出功能性的CD8+CXCR6+ T效应细胞亚群： T细胞是肿瘤微环境中第二丰富的免疫细胞。研究发现了一群表达CXCR6的长效效应CD8+ T细胞，它们高表达IL7R、LAMP1（CD107a）和KLRD1。拟时序分析显示，从初始T细胞到效应T细胞的转变伴随着CXCR6、PRF1和TBX21的持续激活。 * CD8+CXCR6+ T细胞随疾病进展而减少： 流式细胞术证实，CD8+CXCR6+ T细胞在刺激后能分泌更多的GZMB和PRF1，具有更强的细胞毒功能。然而，单细胞数据和免疫荧光结果显示，在恶性程度高的前列腺癌（如NEPC）患者中，CD8+CXCR6+ T细胞的比例显著降低。TCGA数据也显示CD8A与CXCR6表达呈强正相关（r=0.82）。这表明CXCR6的表达对CD8+ T细胞的存活和细胞毒性至关重要，其丢失可能加速癌症进展。

3. 髓系细胞：巨噬细胞的状态转换与新型TAM亚群 * 鉴定出新型TAM-macro-2亚群： 髓系细胞重聚类发现了7个亚群，其中包括一个几乎只存在于癌症患者中的新型肿瘤相关巨噬细胞（TAM）亚群，命名为TAM-macro-2。该亚群特征性地缺失共刺激分子CD86（对T细胞激活至关重要）和CDKN1A的表达，且不分泌T细胞趋化因子CCL3、CCL4和CXCL8。IHC和IF证实，随着肿瘤进展，CD68+CD86-巨噬细胞增多。该亚群富集于中性粒细胞脱颗粒等促癌通路，可能被肿瘤细胞“劫持”以抑制免疫反应。 * ADT诱导具有潜在抗癌活性的IL1B-NLRP3巨噬细胞： 在短期ADT治疗的患者（PCA-4）中，富集了高表达IL1B和NLRP3的巨噬细胞亚群（IL1B-NLRP3 macro）。富集分析提示该亚群可能具有调节炎症反应和负向调控细胞增殖的潜在抗癌活性。 * 巨噬细胞命运决定轨迹： 拟时序分析揭示了巨噬细胞在肿瘤微环境中的两种主要分化轨迹。分支点分析（BEAM）显示，ATF3和IL1B在倾向于促炎表型的细胞命运2中高表达，而LGALS1和LGALS3在倾向于免疫抑制表型的细胞命运1中高表达。

4. 中性粒细胞：具有矛盾功能的两个状态 * 活化与失能中性粒细胞亚群： 中性粒细胞被分为两个亚群：“活化中性粒细胞”（高表达NLRP3, CD44, KLF4）和“失能中性粒细胞”（高表达ALOX5AP, TXNIP）。 * 功能与预后意义相反： “活化中性粒细胞”高表达HLA-DPA1等抗原呈递相关基因，富集于抗原加工呈递和趋化因子产生等通路，其标志基因（HLA-DPA1, HLA-DRA, IL1B）在肺癌、肾癌等肿瘤中与良好预后相关。而“失能中性粒细胞”富集于中性粒细胞脱颗粒、VEGF-VEGFR2通路、中性粒细胞胞外陷阱（NET）形成等通路，其标志基因G0S2在多种肿瘤中与不良预后相关。在晚期前列腺癌（如NEPC）患者中，失能中性粒细胞比例显著增加，而ADT后活化中性粒细胞比例增加。

5. 成纤维细胞异质性：FAP+亚群塑造免疫抑制微环境 * 鉴定出五个成纤维细胞亚群： 包括MYH11+α-SMA+成纤维细胞、CCL21+成纤维细胞/周细胞、PDGFRA+成纤维细胞、抗原呈递成纤维细胞以及POSTN+CTHRC1+FAP+成纤维细胞。 * FAP+成纤维细胞在晚期前列腺癌中富集并诱导Treg分化： POSTN+CTHRC1+FAP+成纤维细胞亚群在NEPC患者中占主导地位。细胞通讯分析显示，成纤维细胞主要通过TIGIT和TGF-β信号通路与T细胞相互作用。小鼠共培养实验证明，从晚期前列腺癌模型（DKO小鼠）分离的CAFs比从对照模型分离的CAFs能诱导更多的Treg分化。IF和IHC显示，在人类NEPC组织和NEPC小鼠模型中，FAP+成纤维细胞与FOXP3+ Tregs在空间上紧密相邻。生存分析表明，FAP+成纤维细胞特征基因的高表达与患者更短的无进展间期（PFI）显著相关。这表明FAP+成纤维细胞通过TGF-β等信号通路促进Treg分化，从而在晚期前列腺癌中塑造了一个免疫抑制微环境。

五、 研究结论与意义 本研究通过整合单细胞多组学技术，以前所未有的分辨率系统描绘了前列腺癌阶段特异性的肿瘤微环境细胞图谱，并揭示了其随疾病进展的动态演变和细胞间互作网络。主要结论包括：1）ADT治疗后残留的SOX9highARlow Club细胞通过激活Wnt/β-catenin通路获得干细胞样状态，可能是治疗抵抗和疾病复发的细胞来源；2）CD8+CXCR6+效应T细胞的丧失与疾病恶性进展相关，而新型CD86- TAM-macro-2亚群和失能中性粒细胞可能促进了免疫抑制；3）FAP+成纤维细胞在晚期前列腺癌中富集，并通过诱导Treg分化主动塑造免疫抑制微环境，促进肿瘤进展。

本研究的科学价值在于：首次在前列腺癌中系统性地整合单细胞转录组、空间位置信息和染色质可及性数据，全面解析了上皮细胞、免疫细胞和基质细胞在疾病演进过程中的协同变化，为理解前列腺癌异质性、治疗抵抗和免疫逃逸机制提供了全新的多层次视角。其应用价值体现在：鉴定出多个潜在的诊断生物标志物（如KLK12 for CRPC）和治疗靶点（如SOX9/KLF5/Wnt通路用于克服ADT耐药，CXCR6用于增强T细胞功能，FAP+成纤维细胞用于解除免疫抑制），为开发针对特定细胞亚群的精准治疗策略（如联合靶向治疗、免疫治疗）提供了重要的理论依据和实验基础。

六、 研究亮点 1. 多组学深度整合： 创新性地将scRNA-seq、空间转录组学和批量ATAC-seq相结合，不仅获得了细胞类型的转录谱，还解析了其空间分布关系和表观遗传调控变化，提供了更全面的生物学图景。 2. 系统性发现新颖细胞亚群与状态转换： 鉴定出多个具有重要功能意义的新细胞亚群，如SOX9highADT耐药Club细胞、CD8+CXCR6+效应T细胞、CD86- TAM-macro-2、功能迥异的中性粒细胞亚群以及免疫抑制性的FAP+成纤维细胞，并描绘了它们在疾病进程中的动态变化轨迹。 3. 强调细胞间通讯与微环境重塑： 不仅描述了细胞组成，更深入分析了细胞间相互作用（如FAP+成纤维细胞