Masashi Miyauchi, Yusuke Ito, Fumio Nakahara, Toshya Hino, Fumi Nakamura, Yuki Iwasaki, Taiki Kawagoshi, Junji Koya, Akihide Yoshimi, Shunya Arai, Yuki Kagoya, 和 Mineo Kurokawa 等研究人员，主要来自东京大学医学研究生院血液学和肿瘤学系、东京大学医院细胞治疗与移植医学部，以及与协和麒麟株式会社的联合研究团队，在血液学领域顶级期刊《Blood》（第138卷第24期，2021年12月16日出版）上发表了一项关于利用人诱导多能干细胞（induced Pluripotent Stem Cells, iPSCs）高效生产功能性中性粒细胞（neutrophils）的突破性研究成果，标题为“Efficient production of human neutrophils from iPSCs that prevent murine lethal infection with immune cell recruitment”。
学术背景 中性粒细胞是人体血液中最丰富的白细胞，是抵御细菌和真菌感染的第一道防线，在先天免疫中扮演关键角色。临床上，中性粒细胞功能缺陷或数量严重减少（如化疗后中性粒细胞缺乏症）的患者面临极高的致命感染风险。尽管已有抗菌药物和粒细胞集落刺激因子等支持疗法，感染仍是主要威胁。粒细胞输注（Granulocyte Transfusion, GTX）是一种直接补充中性粒细胞的治疗策略，但其临床应用长期受限于难以从健康捐献者体内获取足够数量的功能性粒细胞。传统的体外生产方法周期长、产量低，无法满足临床需求。因此，开发一种能够大规模、高效生产功能性人中性粒细胞的稳定平台，具有重大的临床意义。本研究旨在利用iPSCs技术，通过基因工程方法建立一种可扩增、可保存的中性粒细胞定向祖细胞（neutrophil-primed progenitors, NeuPs）系，并验证其分化产生的类中性粒细胞（neutrophil-like cells, NeuCs）在体外的功能特性及其在体内对抗致命感染的有效性。
详细工作流程 本研究包含四大核心步骤：1）建立可扩增的NeuPs细胞系；2）体外功能验证；3）体内分布与安全性评估；4）体内抗感染效能及免疫细胞募集作用研究。
第一步：建立可扩增的NeuPs细胞系（NeuPs-xl） 研究团队从人骨髓CD34+细胞或脐带血建立了iPSCs系。他们设计了一套精密的基因工程方案来赋予造血祖细胞（Hematopoietic Progenitor Cells, HPCs）以强大的扩增能力和中性粒细胞定向分化潜能。具体流程如下： 1. 初始诱导与扩增：将iPSCs分化为HPCs后，利用强力霉素（Doxycycline, Dox）诱导的慢病毒系统，使其过表达c-Myc和Bmi1这两个原癌基因，以促进细胞增殖和自我更新，从而获得初步可扩增的祖细胞。 2. 抗凋亡增强与定向优化：然而，仅过表达c-Myc和Bmi1获得的细胞扩增能力仍不足，且会逐渐分化。通过单细胞定量PCR分析中性粒细胞分化过程中的关键转录因子，他们发现CEBPβ在定向过程中扮演重要角色。但CEBPβ同时会驱动终末分化。进一步分析发现，CEBPβ能调节凋亡相关基因。基于此，研究团队引入了第三个基因——抗凋亡蛋白Bcl-xL。在c-Myc/Bmi1诱导约10天后，再通过Dox诱导Bcl-xL的表达。这一组合策略（c-Myc + Bmi1 + Bcl-xL）成功建立了高度可扩增的、中性粒细胞定向的祖细胞，命名为NeuPs-xl。 3. 分化与表征：当需要产生成熟的功能细胞时，只需移除Dox，沉默上述三个外源基因，并在含有粒细胞集落刺激因子（G-CSF）的培养基中培养4天，即可将NeuPs-xl高效分化为NeuCs-xl。整个流程可在4天内完成，远快于此前报道的从多能干细胞生产中性粒细胞所需的14天以上。研究通过流式细胞术证实了NeuCs-xl表达中性粒细胞特异性表面蛋白（CD16b, CD66b, CD11b），具有分叶核形态，并能响应脂多糖（Lipopolysaccharide, LPS）刺激发生L-选择素（CD62L）快速脱落等成熟中性粒细胞特征。
研究对象与样本量：研究使用了3个独立的iPSC克隆（包括骨髓来源和脐带血来源）。扩增实验进行了多次重复，数据显示NeuPs-xl在16周内可扩增达到10^23个细胞，这比临床一次粒细胞输注所需细胞数（约10^10）高出10^12倍，证明了其巨大的规模化生产潜力。
第二步：NeuCs-xl的体外功能验证 研究对NeuCs-xl进行了全面的体外功能测试，以评估其是否具备成熟中性粒细胞的关键抗菌功能。 1. 颗粒蛋白与趋化：免疫细胞化学显示NeuCs-xl能产生初级（髓过氧化物酶MPO、中性粒细胞弹性蛋白酶ELANE）、次级（乳铁蛋白LTF）和三级（基质金属蛋白酶9 MMP9）颗粒。Transwell迁移实验表明，NeuCs-xl能响应血清梯度以及白三烯B4（LTB4）和白细胞介素-8（IL-8）等趋化因子发生定向迁移。 2. 吞噬与杀伤：采用革兰氏染色和流式细胞术，证实NeuCs-xl能有效吞噬金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大肠杆菌（Escherichia coli）和白色念珠菌（Candida albicans）。其吞噬效率与从人外周血分离的原代中性粒细胞相当。 3. 氧化爆发与NETs形成：使用二氢罗丹明123检测，证实NeuCs-xl在佛波酯（PMA）刺激下能产生活性氧，具备氧化爆发能力。同时，在PMA刺激后能形成中性粒细胞胞外陷阱（Neutrophil Extracellular Traps, NETs）。 4. 基因表达与信号通路：RNA测序和基因本体论分析显示，NeuCs-xl的基因表达谱与正常中性粒细胞成熟过程一致。LPS刺激后，其炎症因子（如IL1A, IL1B, TNF）和趋化因子（如CXCL8）表达显著上调，并快速激活了NF-κB和MAPK信号通路，表明其具备完整的病原体感知和炎症应答能力。
第三步：NeuCs-xl的体内分布、迁移与安全性评估 研究利用免疫缺陷的NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG)小鼠模型，通过活体成像技术追踪表达荧光素酶2（luc2）的NeuCs-xl。 1. 炎症部位募集：腹腔注射LPS诱发炎症后，再腹腔注射NeuCs-xl。活体成像显示，NeuCs-xl能迅速（1小时内）募集并聚集到腹腔炎症部位，而未注射LPS的小鼠体内NeuCs-xl则呈弥散分布。 2. 静脉注射分布：静脉注射NeuCs-xl后，大部分细胞最初被肺部截留（这是输注细胞的常见现象），但仍有部分进入循环。在慢性金黄色葡萄球菌生物膜感染模型中，静脉注射的NeuCs-xl能在30分钟内迁移至皮下的感染导管部位，证明其具有向感染部位归巢的能力。 3. 安全性（肿瘤性风险）评估：研究对注射了NeuCs-xl的小鼠进行了长期观察。结果显示，无论是静脉还是腹腔注射，NeuCs-xl在体内存活时间较短（约数天至两周），随后被清除，未在小鼠体内检测到持续存活或增殖的细胞。长期随访（最长8周）也未发现肿瘤形成迹象，初步证明了该产品的安全性。
第四步：体内抗感染效能及免疫细胞募集机制研究 这是本研究最具创新性的部分，旨在评估NeuCs-xl在复杂免疫环境中的治疗作用。 1. 免疫健全小鼠致死性腹膜炎模型：首先，在正常免疫能力的BALB/c小鼠中，腹腔注射致死剂量的金黄色葡萄球菌诱发急性腹膜炎。单纯注射NeuCs-xl即可剂量依赖性地提高小鼠存活率，高剂量时实现100%存活，效果与人原代中性粒细胞相当。这直接证明了NeuCs-xl具有体内抗感染能力。 2. 中性粒细胞耗竭模型下的功能验证：为了排除宿主自身中性粒细胞的干扰，研究使用抗Ly6G抗体清除小鼠自身中性粒细胞后，再建立感染模型。此时，注射磷酸盐缓冲液（PBS）对照组死亡率很高，而注射小鼠原代中性粒细胞或人原代中性粒细胞可显著提高存活率。关键结果是：注射NeuCs-xl同样实现了接近完全的存活保护，而注射其前体细胞NeuPs-xl则无效。这强有力地证明，是NeuCs-xl成熟细胞本身的功能（而非作为异种抗原引发的非特异性免疫反应）发挥了保护作用。 3. 免疫细胞募集作用机制探索：研究深入分析了NeuCs-xl如何发挥作用。体外实验发现，NeuCs-xl在接触金黄色葡萄球菌后，能高水平表达多种趋化因子（如CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CXCL2, CXCL8）和细胞因子（如IL1A, IL1B, TNF）。体内实验进一步发现，在感染小鼠腹腔内，NeuCs-xl的注射显著招募了宿主的内源性免疫细胞，包括树突状细胞和巨噬细胞。当使用抗人TLR2抗体阻断NeuCs-xl感知金黄色葡萄球菌的关键通路后，这种对内源性免疫细胞的募集作用被显著削弱，同时其保护效能也降低。这表明NeuCs-xl不仅通过直接吞噬杀菌，还通过分泌细胞因子/趋化因子“呼叫”并激活其他免疫细胞，共同构成了一个放大的免疫防御网络。 4. 白细胞减少症模型下的验证：为了模拟临床粒细胞缺乏患者的状况，研究对小鼠进行亚致死剂量照射，造成严重的白细胞减少，然后再进行感染。在这种宿主免疫细胞极度匮乏的条件下，注射NeuCs-xl依然能显著延长小鼠的生存时间。这为其在未来应用于免疫力低下患者的治疗提供了重要依据。
研究结论与价值 本研究成功建立了一个从人iPSCs生产功能性中性粒细胞的革命性平台。核心结论是：通过过表达c-Myc、Bmi1和Bcl-xL组合，可以获得具有极强扩增能力（临床级规模）和冷冻保存潜力的中性粒细胞定向祖细胞（NeuPs-xl）；这些祖细胞能在4天内快速分化为功能完备的类中性粒细胞（NeuCs-xl）；NeuCs-xl不仅具备成熟中性粒细胞的全部关键抗菌功能，还能在体内有效迁移至感染部位，通过直接杀菌和募集宿主其他免疫细胞的双重机制，预防和治疗致命性细菌感染。
科学价值：1）首次实现了人iPSCs来源中性粒细胞的大规模、快速生产，解决了该领域长期以来的产能瓶颈。2）系统证明了iPSCs来源的NeuCs在复杂体内环境中的完整功能，特别是揭示了其与内源性免疫系统的相互作用（细胞募集），深化了对中性粒细胞免疫调节功能的理解。3）为在体内研究人中性粒细胞的生物学功能提供了一个前所未有的强大平台，可用于研究感染、损伤、自身免疫和癌症等多种生理病理过程中中性粒细胞的作用。
应用价值：该平台有望为中性粒细胞缺乏症患者提供一种“现货型”（off-the-shelf）的粒细胞输注产品。相较于依赖献血者的传统方法，这种方法可实现标准化、规模化生产，且不受配型和供应限制，能随时为急需的患者提供足量的功能性中性粒细胞，具有巨大的临床转化潜力。
研究亮点 1. 方法学的重大创新：组合基因工程策略（c-Myc/Bmi1+Bcl-xL）巧妙平衡了细胞增殖、抗凋亡和分化抑制，实现了NeuPs的“永生样”扩增，产量达到临床适用规模（10^23倍扩增），这是前所未有的突破。 2. 功能验证的系统性与深入性：研究不仅进行了全面的体外功能测试，更通过五种不同的小鼠模型（免疫缺陷鼠炎症/感染模型、免疫健全鼠感染模型、中性粒细胞耗竭模型、免疫细胞募集机制模型、白细胞减少模型），层层递进、严谨地证明了NeuCs-xl在体内的有效性、安全性和作用机制，证据链完整有力。 3. 发现了新的作用机制：明确证明了iPSCs来源的人中性粒细胞不仅能直接杀菌，还能通过TLR2感知病原体，分泌趋化因子主动募集小鼠的树突状细胞和巨噬细胞，共同抵御感染。这超越了传统上对粒细胞输注仅是“细胞补充”的认知，提示了其可能具有免疫调节功能。 4. 快速分化流程：从祖细胞到功能细胞仅需4天，极大缩短了生产周期，提升了应对急性感染的可行性。
其他有价值内容 研究也讨论了该平台的局限性及未来方向，例如：长期培养可能导致NeuPs-xl出现核型异常和衰老迹象；目前方法仍使用血清、饲养层细胞和转基因，未来需要向无血清、无饲养层、无转基因的临床级生产方案迈进；HLA配型问题（可通过基因敲除或使用纯合子iPSC库解决）等。这些讨论为后续的转化研究指明了路径。总体而言，这项研究是干细胞治疗和细胞工程领域的一项里程碑式成果，为攻克粒细胞缺乏相关感染这一临床难题开辟了全新的道路。