胃癌印戒细胞癌（GSRCC）肿瘤免疫微环境单细胞图谱研究
第一作者与机构
本研究由浙江大学医学院附属第二医院胃肠外科的Jing Chen、浙江大学医学院附属第一医院免疫学研究所的Kuai Liu，以及美国贝勒医学院定量与计算生物科学项目的Yikai Luo作为共同第一作者领衔。合作机构包括美国MD安德森癌症中心生物信息学系、浙江大学癌症中心等10余家单位。论文于2023年7月发表在胃肠病学领域顶级期刊Gastroenterology（2023;165:88–103）。
学术背景
胃癌（GC）作为全球发病率第五、死亡率第四的恶性肿瘤，具有高度异质性。其中，胃印戒细胞癌（GSRCC）是Lauren分型中弥漫型胃癌的特殊亚型，以胞质内黏液积聚和偏心核为特征，临床预后极差。尽管已有研究探索了胃癌肿瘤细胞基因组特征，但其肿瘤免疫微环境（TIME, Tumor Immune Microenvironment）的细胞组成与功能状态尚未明确，尤其是GSRCC的免疫逃逸机制。
本研究旨在通过单细胞转录组测序（scRNA-seq）和质谱流式（CyTOF）技术，解析GSRCC与non-GSRCC的TIME差异，揭示免疫无应答（immune irresponsiveness）的关键调控因子，并为免疫治疗提供新靶点。
研究流程与方法
1. 样本与实验设计
- 队列设计：共纳入32例晚期胃癌患者（20例scRNA-seq，12例CyTOF），分为GSRCC（n=9）与non-GSRCC（n=23），所有样本均为未经放化疗的手术新鲜组织。
- 免疫细胞富集：通过流式分选CD45+免疫细胞（纯度>99%），分别进行：
- 靶向scRNA-seq：覆盖T/B细胞受体（TCR/BCR）测序，检测53,768个T细胞和44,787个B细胞。
- T细胞靶向CyTOF：使用抗体面板分析蛋白表达，验证转录组结果。
- 数据整合：与已发表的2个胃癌单细胞数据集（10x Genomics全转录组）进行Harmony算法整合，验证平台一致性。
2. 单细胞聚类与注释
- T细胞亚群：通过UMAP降维和标记基因（如FOXP3、CXCL13、HAVCR2）鉴定出8个CD4+亚群（如滤泡辅助性T细胞TFH、Th17、调节性T细胞Treg）和5个CD8+亚群（如效应T细胞Teff、耗竭T细胞Tex、组织驻留记忆T细胞Trm）。
- B细胞亚群：分为初始B细胞（mature-naive）、记忆B细胞（memory-IgM+/IgM-）和浆细胞（IgG-PC/IgA-PC）。
3. 功能与动态分析
- 克隆扩增分析：基于TCR/BCR序列评估克隆扩增程度，发现GSRCC中CD4+和CD8+ T细胞扩增显著受限。
- 伪时间轨迹：使用Slingshot算法揭示T细胞分化路径，发现GSRCC中Th17向TFH的转换受阻。
- 细胞互作：通过CellPhoneDB分析CXCL13-CXCR5信号轴，发现GSRCC中CD8+ Tex细胞来源的CXCL13对三级淋巴结构（TLS）形成的调控减弱。
4. 空间验证
- 多重免疫荧光：在独立队列（68例non-GSRCC vs 26例GSRCC）中证实GSRCC的TLS数量显著减少，且CXCL13+CD8+ T细胞空间分布异常。
主要发现
免疫静默微环境：与非GSRCC相比，GSRCC的TIME呈现“静默”状态：
- T细胞功能抑制：CD4+和CD8+ T细胞的活化标记物（如IFNG、GNLY）表达降低，耗竭标记物（PD-1、LAG3）减少，但非功能性耗竭（CXCL13+ Tex）占主导。
- B细胞应答缺陷：记忆B细胞向浆细胞分化受阻，体细胞高频突变（SHM）水平降低，IgG抗体分泌能力下降。
CXCL13的核心调控作用：
- 来源多样性：CXCL13主要由TFH、Th17和CD8+ Tex细胞分泌，在non-GSRCC中促进TLS形成，但在GSRCC中表达显著降低。
- 临床预测价值：通过分析已发表的免疫检查点抑制剂（ICB）治疗队列，发现CXCL13表达水平可预测GC患者对PD-1抑制剂的反应（Spearman r=0.43，P=0.003）。
TLS形成障碍：GSRCC中CXCL13信号减弱导致TLS结构不完整，削弱了T/B细胞的协同抗肿瘤作用。
结论与意义
- 科学价值：首次在单细胞层面绘制了GSRCC的适应性免疫图谱，提出“CXCL13-TLS-免疫应答”轴是GSRCC免疫治疗耐受的关键机制。
- 临床启示：
- 对于non-GSRCC患者，传统化疗联合ICB可能有效；
- 针对GSRCC，需开发靶向增强CD8+ Tex细胞CXCL13分泌能力的策略，以逆转免疫静默状态。
研究亮点
- 技术创新：结合靶向scRNA-seq和CyTOF，首次实现胃癌TIME的多组学高分辨率解析。
- 发现新颖性：揭示CXCL13+ CD8+ Tex细胞是协调TIME活化的核心媒介，其表达水平可作为ICB疗效的生物标志物。
- 临床转化潜力：为GSRCC的免疫治疗耐药提供了明确的干预靶点（如CXCL13替代疗法或TLS诱导策略）。
局限性与展望
本研究样本量较小（n=32），且为观察性设计。未来需通过功能实验（如CXCL13基因编辑模型）进一步验证其机制。此外，探索靶向CXCL13的联合治疗策略将是重要方向。