近日，由Peking University Third Hospital Cancer Center的Long Chen、Peking University College of Chemistry and Molecular Engineering的Bo Cheng、Zhanqun Yang、Mengzhu Zheng等作为共同第一作者，联合Jian Lin、Xing Chen、Hongyan Guo等通讯作者合作完成的一项创新性研究，以题为“Chemical engineering of γδ T cells with cancer cell-targeting antibodies for enhanced tumor immunotherapy”的研究论文形式，发表于National Science Review期刊，并于2025年6月27日在线发表。该研究开创性地利用化学工程策略改造免疫细胞表面，为增强过继性细胞疗法（Adoptive Cell Therapy）的抗肿瘤效果提供了全新、高效的平台。
一、学术背景与研究目的
本项研究隶属于肿瘤免疫治疗和化学生物学交叉领域。γδ T细胞作为一类独特的T淋巴细胞亚群，其T细胞受体（TCR）不依赖于主要组织相容性复合体（MHC）识别抗原，这使得它们成为同种异体过继细胞治疗的理想候选者，可避免移植物抗宿主病（GvHD）风险。然而，与大多数用于过继转移的免疫细胞类似，未经改造的γδ T细胞在临床应用中面临肿瘤靶向效率低、输注细胞激活有限等挑战，导致疗效受限。
为克服这些局限性，已有研究尝试对γδ T细胞进行基因工程改造，例如引入嵌合抗原受体（CAR），但该过程通常成本高昂、耗时较长。相比之下，细胞表面化学工程作为一种通用且灵活的策略，在调节自然杀伤（NK）细胞、αβ CAR-T细胞等功能方面显示出巨大潜力。研究人员设想，能否通过化学方法在γδ T细胞表面安装肿瘤靶向功能模块，从而赋予其增强的抗肿瘤活性和易于生产的优势？本研究的核心目标即是开发一种化学工程策略，将靶向抗体高效、特异地偶联到γδ T细胞表面，构建“抗体-γδ T细胞”偶联物，并系统评估其体外和体内的抗肿瘤功效及作用机制。
二、详细研究流程与方法
本研究流程系统而严谨，主要包含以下几个关键步骤：
第一步：筛选最佳的细胞表面抗体锚定位点。 研究首先评估了γδ T细胞表面不同生物分子作为抗体锚定位点的潜力。这些分子包括膜脂质、细胞表面蛋白质、糖链内部（O-糖基化和N-糖基化）以及糖链末端（唾液酸），它们与细胞膜的距离依次增加。研究人员使用四种含有叠氮（Azide）生物正交官能团的化学报告分子分别标记这些位点：Azido-choline (Az-Cho) 标记膜脂质，L-Azidohomoalanine (AHA) 标记蛋白质，1,6-di-O-propionyl-N-azidoacetylgalactosamine (1,6-Pr2 GalNAz) 标记O-糖链/GalNAc，以及1,6-di-O-propionyl-N-azidoacetylmannosamine (1,6-Pr2 ManNAz) 标记末端唾液酸。将扩增纯化后的人源γδ T细胞（纯度>95%）与不同浓度的报告分子孵育24小时，然后通过无铜点击化学与DBCO-生物素反应，再用链霉亲和素-Alexa Fluor 488染色，通过流式细胞术和共聚焦荧光显微镜分析标记效率。结果显示，使用200 μM 1,6-Pr2 ManNAz标记末端唾液酸能达到最高的标记强度，且饱和浓度（100 μM）下的信号远高于其他分子。随后，研究人员将DBCO修饰的抗HER2单克隆抗体（αHER2-DBCO）通过点击化学连接到经不同报告分子标记的γδ T细胞上。流式和成像分析证实，1,6-Pr2 ManNAz标记的细胞表面结合了最多的抗体。功能实验进一步证明，基于1,6-Pr2 ManNAz标记构建的αHER2-γδ T细胞在杀伤HER2过表达的乳腺癌细胞系（MDA-MB-231-hHER2和MDA-MB-453）时，展现出最高的细胞毒性。这证实了将靶向抗体安装在最外层的细胞表面唾液酸上，能赋予抗体-γδ T细胞偶联物最佳的靶标可及性和杀伤效果。
第二步：开发快速、特异的唾液酸标记新方法。 选定唾液酸作为锚定位点后，研究团队进一步优化标记策略。他们比较了包括N-azidoacetylmannosamine (ManNAz)、全乙酰化ManNAz (Ac4 ManNAz)、1,6-Pr2 ManNAz以及新开发的1-O-acetyl-N-azidoacetyl-mannosamine-6-bis(S-acetyl-2-thioethyl)-phosphate (AMS-ManNAz-P) 在内的多种非天然糖。研究发现，Ac4 ManNAz会诱导蛋白质发生非酶催化的S-糖基化修饰，这种修饰会影响RhoA等蛋白的活性，并损害γδ T细胞的活化（CD25表达下降）。而AMS-ManNAz-P则不会引起S-糖基化修饰，对细胞活性无影响。在标记动力学和效率方面，AMS-ManNAz-P表现突出：仅需2小时孵育即可产生显著高于其他糖类的标记信号，4小时的标记强度甚至超过了ManNAz和1,6-Pr2 ManNAz孵育24小时的水平。利用他们之前开发的点击化学结合糖蛋白质组学技术（click-IG），研究人员确认了AMS-ManNAz-P成功地将叠氮基团特异性地整合到了细胞表面唾液酸上。因此，这种基于AMS-ManNAz-P的快速代谢聚糖标记（FMGL）策略被确立为本研究的核心化学工程平台。
第三步：构建并表征靶向PD-L1的γδ T细胞偶联物（αPD-L1-γδ T细胞）。 研究选择在多种肿瘤中高表达的程序性死亡配体1（PD-L1）作为靶点。将一个PD-L1特异性的纳米抗体（αPD-L1）通过其赖氨酸残基与DBCO-NHS酯反应，进行可控的DBCO修饰（每个纳米抗体约连接一个DBCO），修饰后的纳米抗体保持了与PD-L1的结合亲和力。随后，将经过AMS-ManNAz-P预标记的γδ T细胞与αPD-L1-DBCO通过点击化学反应结合，成功构建了αPD-L1-γδ T细胞。定量分析表明，平均每个γδ T细胞表面共价连接了约6×10^7个αPD-L1分子，且该抗体在细胞表面能稳定存留长达96小时。体外功能实验显示，αPD-L1-γδ T细胞能有效结合PD-L1阳性的卵巢癌细胞系（OVCAR-8），并释放颗粒酶B（GrB）和干扰素-γ（IFN-γ）等细胞毒性因子。与未改造的γδ T细胞相比，αPD-L1-γδ T细胞对OVCAR-8、A2780-DDP和U251等多种PD-L1阳性癌细胞系展现出显著增强且时间依赖性的杀伤能力。一系列对照实验（如使用非靶向抗体αCD7、用游离αPD-L1阻断靶点、在PD-L1阴性细胞上测试等）均证实，增强的细胞毒性特异性依赖于αPD-L1与肿瘤细胞表面PD-L1的结合。更重要的是，该策略对来自卵巢癌患者的原代癌细胞（分离自原发灶或腹水）同样有效，即使这些细胞PD-L1表达水平相对较低，αPD-L1-γδ T细胞也能引发强烈的杀伤和细胞因子释放。
第四步：探究αPD-L1-γδ T细胞杀伤肿瘤细胞的机制。 研究人员深入探索了其杀伤作用的分子机制。通过使用中和抗体阻断γδ TCR、共刺激受体（NKG2D、DNAM-1）或死亡配体（FASL、TRAIL），发现αPD-L1-γδ T细胞的杀伤效力均被显著抑制，表明其依赖于γδ T细胞固有的活化、共刺激和死亡受体信号通路。有趣的是，在共培养体系中，研究人员观察到癌细胞出现“气泡样”形态，并检测到ATP和高迁移率族蛋白B1（HMGB1）的释放，这是细胞焦亡（Pyroptosis）的典型特征。进一步的蛋白质印迹分析证实，在OVCAR-8、SK-OV-3、U251癌细胞系以及患者原代癌细胞中，αPD-L1-γδ T细胞的共培养诱导了Gasdermin E（GSDME）蛋白被切割并释放其N端片段，同时Caspase-3被激活和切割。这些是GSDME介导的细胞焦亡的关键分子事件。当使用靶向EGFR的纳米抗体（αEGFR）构建类似的偶联物时，也能在EGFR阳性癌细胞中诱导焦亡，说明这种化学工程化的γδ T细胞诱导癌细胞焦亡的现象具有普适性，不依赖于所连接的特定抗体或靶抗原。机制模型归纳为：表面抗体引导γδ T细胞靶向结合肿瘤细胞，进而触发γδ TCR与肿瘤细胞上BTN3A1/2A1复合物等的相互作用，激活γδ T细胞并释放效应分子，最终激活癌细胞内的Caspase-3，切割GSDME导致细胞焦亡。
第五步：评估αPD-L1-γδ T细胞的体内抗肿瘤活性。 研究在免疫缺陷的NSG小鼠中建立了OVCAR-8卵巢癌细胞的腹膜转移瘤模型。小鼠被随机分为三组，分别接受腹腔注射磷酸盐缓冲液（PBS）、未改造γδ T细胞或αPD-L1-γδ T细胞治疗（每4天一次，共四次）。通过生物发光成像监测肿瘤生长，并记录小鼠体重和生存期。结果显示，与PBS组和未改造γδ T细胞组相比，αPD-L1-γδ T细胞治疗能更有效地抑制肿瘤生长，显著延长荷瘤小鼠的中位生存期（从35.5天延长至65天）。此外，研究还证实了细胞表面通过唾液酸连接的抗体能抵抗外切唾液酸酶的水解，确保了偶联物在体内的稳定性。静脉注射给药的αPD-L1-γδ T细胞也显示出与腹腔给药相当的抗肿瘤疗效。
第六步：揭示αPD-L1-γδ T细胞对肿瘤微环境（TME）的重塑作用。 鉴于细胞焦亡与抗肿瘤免疫密切相关，研究人员探究了αPD-L1-γδ T细胞是否能够重塑TME。体外Transwell实验表明，αPD-L1-γδ T细胞与OVCAR-8细胞共培养后的上清液能显著招募T细胞，其中CD8+ T细胞的招募比例和活化水平（CD69表达）更高。在体内实验中，对肿瘤组织浸润淋巴细胞的分析发现，αPD-L1-γδ T细胞治疗后，肿瘤内Vδ2+ γδ T细胞和CD8+ T细胞的浸润显著增加，且这些细胞大多处于活化和中心记忆状态，耗竭标志物表达低。细胞因子检测发现，共培养上清中CCL5（一种趋化因子）的释放量显著升高。使用CCR5（CCL5的受体）拮抗剂马拉维罗（Maraviroc）能够有效抑制CD8+ T细胞的招募和活化。这表明αPD-L1-γδ T细胞通过诱导癌细胞焦亡，至少部分地通过CCL5/CCR5轴招募并激活CD8+ T细胞，从而将TME重塑为免疫活跃的状态。
三、主要研究结果与逻辑推进
本研究的结果环环相扣，逻辑严密。首先，通过系统性的筛选，确立了细胞表面最外层的唾液酸作为化学工程改造γδ T细胞的最佳锚定位点，这为后续高效构建功能偶联物奠定了基础。其次，通过对比多种非天然糖，开发并优化了基于AMS-ManNAz-P的FMGL策略，该策略具有标记快速、效率高、特异性强且不影响细胞活性的优点，是本研究成功的关键技术平台。利用此平台，研究成功构建了靶向PD-L1的γδ T细胞偶联物，并在体外多层次（细胞系、患者原代细胞）证明了其特异且强效的细胞毒性，这直接回答了研究的核心问题——化学工程能否增强γδ T细胞的抗肿瘤活性。
随后，深入的机制研究揭示了这种增强杀伤的新颖作用模式：抗体引导的靶向作用结合γδ T细胞固有的杀伤机制，最终通过激活Caspase-3/GSDME通路诱导了癌细胞的焦亡，而非简单的凋亡。这一发现将化学工程改造与一种已知能激发抗肿瘤免疫的细胞死亡形式联系起来。接着，体内实验证实了偶联物在活体动物模型中抑制肿瘤生长、延长生存期的显著疗效，验证了其治疗潜力。最后，对肿瘤微环境的分析揭示了该疗法更深层次的免疫调节功能：即通过诱导焦亡释放趋化因子，招募并激活内源性的CD8+ T细胞，协同攻击肿瘤。这一系列结果从“构建方法”到“体外功效”，再到“分子机制”、“体内疗效”，最后到“免疫微环境调控”，逐步深化，完整地阐释了抗体-γδ T细胞偶联物的作用全景。
四、研究结论与价值意义
本研究得出结论：利用快速代谢聚糖标记（FMGL）和点击化学对γδ T细胞表面唾液酸进行化学工程改造，可以高效、通用地构建抗体-γδ T细胞偶联物。以αPD-L1-γδ T细胞为例，该偶联物展现出卓越的靶向性、增强的体外和体内抗肿瘤活性。其作用机制包括：1）通过抗体实现精准靶向；2）诱导癌细胞发生GSDME介导的焦亡；3）通过CCL5/CCR5轴重塑肿瘤微环境，招募和激活CD8+ T细胞。
本研究的科学价值在于：1）提出了一种全新的免疫细胞改造策略：不同于复杂的基因工程，这种化学方法具有通用、快速、灵活、可逆（理论上）且易于质量控制等潜在优势，为过继性细胞治疗提供了新的技术路径。2）揭示了化学工程化免疫细胞的新颖作用机制：首次报道了通过表面抗体武装的γδ T细胞可诱导癌细胞焦亡，并系统阐述了其后续的免疫微环境重塑效应，丰富了肿瘤免疫治疗的理论基础。3）建立了可扩展的平台技术：基于FMGL的平台不仅可用于连接抗体，理论上还可连接其他功能分子（如细胞因子、核酸适配体等），具有广泛的应用前景。
其应用价值体现在为开发“现货型”（off-the-shelf）、非基因编辑的同种异体γδ T细胞疗法提供了强有力的工具。由于γδ T细胞本身MHC非限制性的特性，结合这种化学修饰，有望实现一种易于生产、可多次输注、针对多种实体瘤的通用型免疫治疗方案。
五、研究亮点
六、其他有价值内容
文章中提及，这种化学工程策略的质量控制（如不同批次间修饰密度的一致性）是未来临床转化中需要进一步优化的方向。此外，该平台具有极高的灵活性，理论上可以便捷地更换靶向抗体以针对不同肿瘤抗原（如EGFR、HER2等），或进一步为偶联物装备“开关”以提升其安全性和可控性，这些均为未来的研究指明了方向。